Analysis of the Catalytic Mechanism of Bifunctional Triterpene/Sesquarterpene Cyclase: Tyr167 Functions To Terminate Cyclization of Squalene at the Bicyclic Step
- 作者
- Liudmila Tenkovskaia, Mizuki Murakami, Kotone Okuno, Daijiro Ueda, Tsutomu Sato
- 杂志
- ChemBioChem（2017）
- DOI
- 10.1002/cbic.201700329
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析双功能三萜/倍半萜环化酶（TC）如何针对不同底物（C35的tetraprenyl-β-curcumene和C30的squalene）产生不同的环化模式，特别是Tyr167在角鲨烯环化中终止于双环步骤的作用。
研究策略
通过定点突变（Y167A、Y167L、Y167F、Y167W、Y167A/L596F）结合GC-MS和NMR产物结构解析，分析突变对产物分布的影响，并与角鲨烯-藿烯环化酶（SHC）的已知机理进行对比。
核心内容
该研究通过定点突变与产物结构解析，揭示了双功能三萜/倍半萜环化酶（TC）中Tyr167残基如何控制角鲨烯环化的终止步骤。研究构建了Y167A、Y167L、Y167F、Y167W及Y167A/L596F等突变体，并利用GC-MS和NMR鉴定产物。野生型TC催化角鲨烯主要产生双环产物4（85.8%）以及少量四环产物5和五环产物6；而Y167A突变使产物分布显著改变，双环产物降至24.2%，五环产物升至32.1%，并新产生23.6%的三环化合物10。其他侧链体积较大的突变体仅产生微量10，证明Tyr167侧链体积是决定角鲨烯环化终止于双环步骤的关键因素。双突变Y167A/L596F则使产物集中于4和10。新化合物10经鉴定为3-脱氧arabidiol，一种含C-14叔醇的三环三萜。该工作首次解析了onocerosid合酶的催化机制，表明TC活性位点与角鲨烯-藿烯环化酶存在结构差异，为高效生物合成onocerosids类活性三萜提供了酶工程基础。
创新点
首次利用突变酶分析onocerosid合酶的催化机制；发现Y167侧链体积大小决定了角鲨烯环化终止在双环步骤；产生并鉴定了一种新的非天然三环三萜化合物3-脱氧arabidiol。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus megaterium | 三萜/倍半萜生物合成 | BmeTC | TC (bifunctional triterpene/sesquarterpene cyclase) | 催化 | TC的天然来源，催化角鲨烯和tetraprenyl-β-curcumene的环化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜/倍半萜生物合成 | BmeTC（含Y167A、Y167L、Y167F、Y167W、Y167A/L596F突变体） | TC突变体（Y167A、Y167L、Y167F、Y167W、Y167A/L596F） | 催化 | 重组表达用于酶活性分析和产物鉴定 |
| — | 三萜/倍半萜生物合成 | SHC | Squalene-hopene cyclase (SHC) | 催化 | 与TC比较的环化酶，约30%序列同源性，用于机理对照 |
关键发现
野生型TC催化角鲨烯(3)产生双环产物4（85.8%）、四环产物5（9.5%）和五环产物6（4.7%），但无化合物10。Y167A突变显著改变产物分布：4降至24.2%，5升至20.2%，6升至32.1%，并产生23.6%的新三环化合物10。Y167L、Y167F、Y167W突变体仅产生少量10（分别为2.0%、0.8%、1.6%），表明Y167位侧链体积大小关键。双突变Y167A/L596F产生84.5%的4和15.5%的10，未检测到5和6。化合物10经MS和NMR鉴定为3-脱氧arabidiol（C30H52O），一种带有C-14叔醇和三个乙烯基甲基的三环三萜。
研究结论
Y167位点的侧链体积对终止角鲨烯环化在双环步骤至关重要；TC活性位点结构可能与SHC略有不同，该研究为高效生物合成生物活性onocerosids（如ambrein）奠定了基础。