Biosynthetic Machinery of Diterpene Pleuromutilin Isolated from Basidiomycete Fungi
- 作者
- Yamane, Momoka; Minami, Atsushi; Liu, Chengwei; Ozaki, Taro; Takeuchi, Ichiro; Tsukagoshi, Tae; Tokiwano, Tetsuo; Gomi, Katsuya; Oikawa, Hideaki
- 单位
- Division of Chemistry, Graduate School of Science, Hokkaido University, Sapporo 060-0810, Japan; Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai 981-8555, Japan
- 杂志
- ChemBioChem（2017）
- DOI
- 10.1002/cbic.201700434
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明担子菌中二萜类抗生素截短侧耳素（pleuromutilin）的完整生物合成途径，尤其是所有生物合成酶的具体功能。
研究策略
结合体外酶促反应和体内生物转化实验，利用米曲霉（Aspergillus oryzae）异源表达系统对ple基因簇中的全部酶进行功能表征，并通过突变分析和中间体饲喂实验确定反应顺序。
核心内容
该研究以担子菌截短侧耳素生物合成途径为对象，结合体外酶促反应与体内生物转化实验，利用米曲霉异源表达系统对ple基因簇全部七个酶进行了功能表征。关键发现包括：Ple3是独特的labdane-related二萜合酶，其D311A和D649A两个突变体单独均丧失环化活性而混合可恢复，证明两个结构域协同催化两次环化和环收缩形成5-6-8三环骨架；Ple6催化C3位立体专一性氧化，Ple1催化C14位羟基化，Ple2催化C14位乙酰化，并鉴定出3-羟基premutilin和3,11-二羟基premutilin两个新中间体。生物转化实验揭示了2→3→5和2→4→5两条并行氧化途径。在MPY培养基中，携带ple3和ple4的转化体产premutilin达37 mg/L。此外，米曲霉内源CPR可支持担子菌来源P450的电子传递。该工作完整阐明了从GGPP经环化、氧化、还原和乙酰化修饰生成截短侧耳素的全部酶学步骤，为担子菌萜类天然产物的酶法合成奠定了基础。
创新点
首次完整表征了pleuromutilin生物合成中的所有酶；发现Ple3是独特的labdane-related二萜合酶，催化两次环化并发生环收缩形成5-6-8三环骨架；鉴定了两个新中间体3-羟基premutilin (4)和3,11-二羟基premutilin (5)；证明米曲霉内源CPR能够支持担子菌来源P450的电子传递。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | ple4 | Ple4 | 催化 | GGPP合酶，提供环化前体geranylgeranyl diphosphate (GGPP) |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | ple3 | Ple3 | 催化 | labdane-related二萜合酶，含N端II类环化酶结构域(DxDM)和C端I类环化酶结构域(DDxxD)，催化GGPP两轮环化生成premutilin |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | ple6 | Ple6 | 催化 | 细胞色素P450，催化premutilin C3位立体专一性氧化 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | ple5 | Ple5 | 催化 | 细胞色素P450，催化C11位羟基化 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | ple7 | Ple7 | 催化 | 短链脱氢酶/还原酶，可能参与C3酮基还原 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | ple1 | Ple1 | 催化 | 细胞色素P450，催化mutilin C14位羟基化 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | pleuromutilin生物合成 | ple2 | Ple2 | 催化 | 酰基转移酶，催化C14位乙酰化生成pleuromutilin |
| Clitopilus pseudo-pinsitus ATCC20527 | pleuromutilin生物合成 | ple1-ple7 | Ple1-Ple7 | 催化 | 天然产生菌，用于基因克隆和产物标准品 |
关键发现
AO-ple34转化体在MPY培养基中产生premutilin (2)的产量为37 mg/L（纯化得37.2 mg），GC-MS检测到m/z 290的分子离子峰。新中间体4和5的分子式分别为C20H34O2和C20H34O3，HR-MS（APCI）计算值/实测值分别为341.2253/341.2255（[M+Cl]-）和357.2202/357.2202（[M+Cl]-）。Ple3的D311A和D649A突变体单独均丧失环化活性，但两者混合可恢复活性，证明两个结构域（DxDM和DDxxD基序）协同催化两轮环化。Ple6催化C3位立体专一性氧化（提取α-氢），Ple1催化C14位羟基化，Ple2催化C14乙酰化。生物转化实验表明存在两条从2到5的氧化途径：2→3→5和2→4→5。
研究结论
通过体外酶促反应和米曲霉体内生物转化实验，完整阐明了pleuromutilin的生物合成途径：GGPP在Ple3催化下环化生成premutilin，随后经Ple6、Ple5、Ple7、Ple1和Ple2的氧化、还原和乙酰化修饰生成终产物。该研究为利用米曲霉表达系统酶法合成担子菌萜类天然产物奠定了基础。