Biocatalytic Asymmetric Phosphorylation catalyzed by recombinant Glycerate-2-kinase
- 作者
- Norman Hardt, Birhanu M Kinfu, Jennifer Chow, Bernhard Schoenenberger, Wolfgang R. Streit, Markus Obkircher, Roland Wohlgemuth
- 杂志
- ChemBioChem（2017）
- DOI
- 10.1002/cbic.201700201
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
高效合成纯的D-甘油酸-2-磷酸，因为该代谢物是多种代谢通路的关键中间体，化学合成路线步骤多、纯度低，需要开发直接、高选择性的酶法磷酸化方法。
研究策略
选择来自Thermotoga maritima的甘油酸-2-激酶，在大肠杆菌中重组表达并纯化，利用磷酸烯醇丙酮酸/丙酮酸激酶系统实现ATP再生，通过一步生物催化磷酸化D-甘油酸生成D-甘油酸-2-磷酸，并用NMR监测反应进程。
核心内容
研究者从海洋嗜热菌Thermotoga maritima中克隆了甘油酸-2-激酶基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了重组表达与纯化。该酶以磷酸烯醇丙酮酸/丙酮酸激酶系统实现ATP再生，通过一步生物催化反应对D-甘油酸进行不对称磷酸化，生成目标产物D-甘油酸-2-磷酸，并利用31P NMR实时监测反应进程。结果显示，该酶具有严格的D-对映选择性，对L-甘油酸完全不反应；以DL-甘油酸为底物时转化率为50%，而纯D-甘油酸几乎完全转化（近100%）。酶学动力学参数测定显示，其对D-甘油酸的Km为0.13 mM，kcat为5.4×10⁻² s⁻¹，催化效率达4.0×10⁴ M⁻¹ s⁻¹。酶的最适pH为9.2，且在低温含防腐剂条件下储存数月活性稳定。克级规模制备获得1.255 g白色固体，产物对映体比例D:L为98.3:1.7，产率达72%。相比传统化学合成路线，该酶法策略步骤少、产物光学纯度高且可持续，为D-甘油酸-2-磷酸这一关键代谢中间体的高效制备提供了简便可行的生物催化方案。
创新点
1. 利用重组甘油酸-2-激酶实现高度对映选择性磷酸化，仅磷酸化D-甘油酸，L-甘油酸完全不反应；2. 反应步骤少（一步），产物纯度高；3. 采用31P NMR实时监测反应，便于过程优化；4. 成功进行克级规模制备，产率72%。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甘油酸代谢/糖酵解 | 甘油酸-2-激酶基因（来自Thermotoga maritima） | 甘油酸-2-激酶（Glycerate-2-kinase） | 催化 | 重组表达为MBP融合蛋白，经Factor Xa蛋白酶切去标签获得活性酶 |
| Thermotoga maritima | 甘油酸代谢/糖酵解 | TM1585 | 甘油酸-2-激酶 | 催化 | 酶来源生物体，野生型酶的动力学已有研究 |
| — | ATP再生系统 | — | 丙酮酸激酶（pyruvate kinase） | 能量供给 | 用于磷酸烯醇丙酮酸（PEP）再生ATP |
| — | ATP再生系统 | — | 磷酸烯醇丙酮酸（PEP） | 能量供给 | 磷酸供体，与丙酮酸激酶偶联实现ATP循环 |
关键发现
- 重组甘油酸-2-激酶对D-甘油酸具有严格对映选择性，L-甘油酸不被磷酸化
- DL-甘油酸底物转化率为50%，D-甘油酸几乎完全转化（近100%）。该酶对D-甘油酸的Km为(0.13±0.03) mM，kcat为(5.4±0.7)×10^-2 s^-1，kcat/Km为(4.0±0.05)×10^4 M^-1 s^-1。酶最适pH为9.2，且在4℃含0.02% NaN3条件下储存数月活性不变。产物D-甘油酸-2-磷酸的对映体比例（D:L）为98.3:1.7，克级制备得到1.255 g白色固体，产率72%。
研究结论
重组甘油酸-2-激酶对D-甘油酸具有优异的对映选择性和稳定性，通过一步酶法磷酸化即可制备光学纯的D-甘油酸-2-磷酸，比传统化学路线步骤更少、纯度更高，是一种可持续的合成方法。