Effect of Cation-π Interactions and Steric Bulk on the Catalytic Action of Oxidosqualene Cyclase: A Case Study of Phe728 of β-Amyrin Synthase from Euphorbia tirucalli L
- 作者
- Ryousuke Ito, Ippei Hashimoto, Yukari Masukawa, Tsutomu Hoshino
- 杂志
- Chemistry - A European Journal（2013）
- DOI
- 10.1002/chem.201301917
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明氧化角鲨烯环化酶（OSC）中芳香族残基Phe728通过阳离子-π相互作用及空间位阻对催化活性和环化途径的调控机制。
研究策略
构建F728六个定点突变体（Ala、Ile、Met、His、Tyr、Trp），利用Western blot和GC定量评估体内酶活性，结合产物结构鉴定分析产物分布。
研究路线图
核心内容
该研究以Euphorbia tirucalli来源的β-香树脂醇合酶（EtAS）为模型，系统探究了氧化角鲨烯环化酶中芳香族残基Phe728的催化调控机制。作者构建了F728六个定点突变体并在酵母GIL77中异源表达，通过Western blot与GC定量评估酶活，结合产物鉴定分析环化途径变化。结果显示野生型EtAS的β-amyrin形成活性为5.02 mg/mg蛋白，F728Y突变体活性接近野生型，而F728A、M、H、W突变体活性显著降低。F728H突变体主要生成germanicol（占51%），β-amyrin仅3%；F728W突变体产生13种环状三萜，四环产物总量达27.3%，并鉴定出罕见的isoursenol及新化合物(17E)-dammara-17(20),24-dien-3β-ol。阳离子-π结合能计算显示His 21.0、Tyr 26.9、Phe 27.1、Trp 32.6 kcal/mol。研究表明Phe728通过阳离子-π相互作用稳定碳正离子中间体促进环扩张，空间位阻决定了环化途径与产物立体化学，首次为OSC催化中阳离子-π相互作用的关键作用提供了实验证据。
创新点
首次提供OSC催化中阳离子-π相互作用关键作用的实验证据；开发了体内评估突变OSC酶活性的简单方法；发现新天然产物(17E)-dammara-17(20),24-dien-3β-ol和罕见的isoursenol。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae GIL77 (ΔERG7) | 三萜生物合成 | EtAS | β-amyrin synthase (EtAS) | 催化 | Phe728定点突变体（F728A/F728I/F728M/F728H/F728Y/F728W） |
| Saccharomyces cerevisiae GIL77 | 甾醇生物合成 | ERG7 | lanosterol synthase | 调控 | 敲除ERG7以消除内源羊毛甾醇合酶，保证检测EtAS产物 |
关键发现
- 野生型EtAS的β-amyrin形成活性为5.02 ±
- 79 mg产物/mg蛋白，总三萜活性为5.62 ±
- 17 mg/mg蛋白。F728Y突变体活性接近野生型，而F728A、F728M、F728H、F728W活性显著降低。F728H突变体主要产生germanicol（11，占51%），β-amyrin仅3%，同时产生lupeol（15%）和ψ-taraxasterol（8%）。F728W突变体产生13种环状三萜，包括isoursenol（13.2%）、α-amyrin（18.0%）及新化合物20（(17E)-dammara-17(20),24-dien-3β-ol），四环产物总量达27.3%。阳离子-π结合能排序为His
- 0 < Tyr
- 9 < Phe
- 1 < Trp
- 6 kcal/mol。
研究结论
Phe728通过阳离子-π相互作用稳定碳正离子中间体（尤其是仲碳正离子5和7），促进环扩张反应；空间位阻决定环化途径和产物立体化学。本研究首次实验证明OSC催化中阳离子-π相互作用起关键作用。