Mechanisms of the Diterpene Cyclases β-Pinacene Synthase from Dictyostelium discoideum and Hydroperyne Synthase from Streptomyces clavuligerus
- 作者
- Jan Rinkel, Patrick Rabe, Xinlu Chen, Tobias G. Köllner, Feng Chen, Jeroen S. Dickschat
- 杂志
- Chemistry - A European Journal（2017）
- DOI
- 10.1002/chem.201702704
- 所属领域
- 酶学 / 天然产物生物合成
- 关键词
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解决的核心问题
解析来自盘基网柄菌的β-pinacene合酶和来自棒状链霉菌的hydroperyne合酶两种二萜环化酶的催化机理，特别是含有C2=C3 Z构型双键产物的形成机制。
研究策略
利用多种同位素标记（13C、2H）的GGPP和GLPP底物进行酶促转化，结合NMR和GC-MS分析，追踪氢迁移、去质子化、环化及立体化学过程。
核心内容
该研究解析了来自盘基网柄菌的β-pinacene合酶（DdTPS5）和来自棒状链霉菌的hydroperyne合酶（HpS）两种二萜环化酶的催化机理。利用13C和2H同位素标记的GGPP和GLPP底物进行酶促转化，结合NMR和GC-MS分析追踪氢迁移、去质子化及环化立体化学过程。研究发现DdTPS5催化GGPP生成β-pinacene，反应涉及1,2-氢迁移和从C14的立体特异性去质子化；(R)-(1-2H)GGPP转化导致H1R特异性丢失，而(S)-对映体保留H1S。HpS从GGPP生成hydroperyene、hydroperynol、isoelisabethatriene等多种产物，通过13C标记实验分离并鉴定了不稳定中间体prehydropyrene，证明1,3-氢迁移立体专一地迁移H1R。两种酶均通过GGPP异构化为GLPP引入C2=C3 Z构型双键，且两种GLPP对映体均可被接受但效率低于GGPP。该策略与单萜和倍半萜环化酶中利用烯丙基焦磷酸转位引入Z双键的机制一致，揭示了二萜环化酶中Z型双键引入的普遍规律。
创新点
首次鉴定DdTPS5为β-pinacene合酶；发现并分离了HpS催化反应中预测的稳定中间体prehydropyrene；确定了HpS主要产物的绝对构型；证明两种酶均通过GGPP异构化为GLPP引入Z双键，且两种GLPP对映体均可被接受。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | DdTPS5 | β-pinacene synthase | 催化 | 异源表达，催化GGPP环化生成β-pinacene (1) |
| Dictyostelium discoideum | 二萜生物合成 | DdTPS5 | β-pinacene synthase | 催化 | 酶来源生物，该酶为首次表征的β-pinacene合酶 |
| Streptomyces clavuligerus | 二萜生物合成 | hydroperyne synthase (HpS) | hydroperyne synthase | 催化 | 酶来源生物，催化GGPP生成hydroperyene等二萜产物 |
| Escherichia coli | 二萜生物合成 | hydroperyne synthase (HpS) | hydroperyne synthase | 催化 | 异源表达，产物包括3、4、5、6及7 |
关键发现
- DdTPS5被鉴定为β-pinacene合酶，催化GGPP生成β-pinacene（1），该反应涉及1,2-氢迁移和从C14去质子化
- (R)-(1-2H)GGPP转化导致H1R特异性丢失，而(S)-对映体保留H1S，表明去质子化步骤具有立体特异性
- HpS从GGPP生成hydroperyene (3)、hydroperynol (4)、isoelisabethatriene (5)、微量isoelisabethatriene B (6)以及bifloro-4,10(19),15-triene (7)
- 通过13C标记实验发现并分离了不稳定中间体2，命名为prehydropyrene
- 用(S)-(1-13C,1-2H)GGPP转化HpS，产物2、3、4中C1出现增强三重峰，而5为单峰，证明1,3-氢迁移立体专一地迁移H1R
- (−)-5的旋光度[α]D20=−5.5°(c 0.1, C6D6)，其绝对构型与珊瑚来源的isoelisabethatriene相反。
研究结论
两种二萜环化酶PcS和HpS都通过GGPP异构化为GLPP来引入Z构型双键，且两种GLPP对映体均可被酶接受但效率低于GGPP。该策略与单萜和倍半萜环化酶中利用烯丙基焦磷酸转位引入Z双键的机制一致。