Isolation, characterization and long term preservation of mutant strains of Xanthophyllomyces dendrorhous
- 作者
- Marcelo Baeza, Patricio Retamales, Dionisia Sepúlveda, Patricia Lodato, Antonio Jiménez, Victor Cifuentes
- 单位
- Departamento de Ciencias Ecológicas, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile; Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Universidad Autonoma de Madrid, España
- 杂志
- Journal of Basic Microbiology（2009）
- DOI
- 10.1002/jobm.200800096
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
Xanthophyllomyces dendrorhous是产虾青素的重要工业酵母，但遗传学研究受限于突变体不稳定和菌株难以长期保存。需要分离具有营养缺陷型标记的突变体以用于类胡萝卜素合成途径和有性周期的遗传分析，并建立简便、有效的实验室菌株保存方法。
研究策略
使用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（NTG）诱变结合制霉菌素富集，从野生型菌株CBS 7918及其衍生的高产生holobasidia菌株S3-88中分离营养缺陷型突变体；通过补充中间产物分析定义突变基因位点；比较三种冷冻保存方法（液氮速冻、4℃预冷、-20℃预冷）与脱水明胶滴（DGD）法在65个月保存期中的效果，并检测菌株形态和营养缺陷型稳定性。
核心内容
该研究以产虾青素的工业酵母Xanthophyllomyces dendrorhous为对象，旨在解决其突变体不稳定及难以长期保存的问题。研究者采用NTG诱变结合制霉菌素富集策略，从野生型菌株CBS 7918中获得了频率高达2×10⁻²的营养缺陷型突变体，远高于ATCC 24230菌株的2.4×10⁻⁴。通过中间产物喂养实验，定义了精氨酸合成途径中的ARG7、ARG3及脯氨酸途径中的PRO3三个基因位点。同时，研究比较了多种保存方法，发现脱水明胶滴法在65个月保存期内细胞存活率达1%至10%，明显优于液氮速冻等冷冻方法，且菌株形态和营养缺陷型特征保持稳定。此外，获得了一株能形成holobasidia但不产生担孢子的A3-2突变体，证明二者在有性周期中是独立事件。该工作为类胡萝卜素合成途径及有性周期的遗传研究提供了可行的突变体资源和简便有效的长期保存手段。
创新点
['首次在CBS 7918菌株中通过NTG诱变获得频率高达2×10^-2的营养缺陷型突变体，明显高于ATCC 24230菌株（2.4×10^-4）', '定义了X. dendrorhous中的ARG7、ARG3和PRO3基因位点', '发现DGD法保存65个月后仍可维持1%-10%的存活率，明显优于冷冻方法，且菌株表型稳定', '获得一株A3-2突变体，其能形成holobasidia但不能形成担孢子，证明二者在有性周期中是独立事件']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 精氨酸生物合成 | ARG7 | 乙酰鸟氨酸乙酰转移酶 | 催化 | 突变阻断N-乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸，导致精氨酸营养缺陷（需要鸟氨酸/瓜氨酸/精氨酸） |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 精氨酸生物合成 | ARG3 | 鸟氨酸氨甲酰转移酶 | 催化 | 突变阻断鸟氨酸转化为瓜氨酸，导致精氨酸营养缺陷（需要瓜氨酸或精氨酸） |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 脯氨酸生物合成 | PRO3 | 吡咯啉-5-羧酸还原酶 | 催化 | 突变阻断P5C转化为脯氨酸，导致脯氨酸营养缺陷（不能利用鸟氨酸/瓜氨酸/精氨酸作为补充） |
关键发现
- ['经NTG和制霉菌素处理后，从CBS 7918菌株获得的营养缺陷型突变频率为2×10^-2，而从ATCC 24230菌株为2.4×10^-4，前者比后者高约100倍。', '分离获得多种营养缺陷型突变体，包括A4-69（白化、精氨酸和甲硫氨酸双重缺陷）和A3-2（亮氨酸缺陷、无担孢子但形成holobasidia）。', '通过中间产物喂养实验定义了精氨酸生物合成途径中的ARG7（阻断N-乙酰鸟氨酸→鸟氨酸）和ARG3（阻断鸟氨酸→瓜氨酸）位点，以及脯氨酸途径中的PRO3（阻断P5C→脯氨酸）位点。', '在冷冻保存方法中，CRYII（4℃预冷2h）存活率最高，但各菌株间差异大
- CRYI（液氮速冻）最差，存活率低于0.002%。CRYII方法的存活率比CRYIII高2到38倍（除菌株ATCC 24202外）。', 'DGD法保存65个月后细胞存活率为1%-10%，比CRYII方法高约一个数量级
- 例如菌株ATCC 24202的DGD回收CFU为9×10^6，而CRYII仅为6×10^3。', '所有经DGD法保存的菌株均维持原有形态学特征（色素、有性结构）和营养缺陷型要求，无污染发生。']
研究结论
DGD脱水明胶滴法是一种简便、廉价且有效的X. dendrorhous菌株长期保存方法，在65个月保存期内能保持高细胞存活率和遗传表型稳定性；同时，利用NTG诱变和制霉菌素富集成功分离了带有营养缺陷型标记的突变体，并初步定义了ARG7、ARG3和PRO3基因位点，为后续类胡萝卜素途径和有性周期的遗传研究奠定了基础。