The use of proton transfer reaction mass spectrometry for high throughput screening of terpene synthases
- 作者
- Alice Di Girolamo, Michele Pedrotti, Alex Koot, Francel Verstappen, Adèle van Houwelingen, Celina Vossen, Harro Bouwmeester, Dick de Ridder, Jules Beekwilder
- 单位
- Laboratory of Plant Physiology, Department of Plant Sciences, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands; Post-Harvest Technology Group, Wageningen Food & Biobased Research, Wageningen Research, Wageningen, The Netherlands; Authenticity & Nutrients Group, Wageningen Food Safety Research, Wageningen Research, Wageningen, The Netherlands; Bioscience, Wageningen Plant Research, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands; Isobionics BV, Geleen, The Netherlands; Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands; Bioinformatics Group, Department of Plant Sciences, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands
- 杂志
- Journal of Mass Spectrometry（2023）
- DOI
- 10.1002/jms.4951
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
开发一种快速、可靠的高通量筛选方法，用于从萜烯合酶突变体文库中筛选出高产突变体，克服传统GC-MS方法通量低、样品制备繁琐的局限。
研究策略
将质子转移反应质谱（PTR-Qi-ToF-MS）与多孔板培养相结合，直接检测培养物顶空中的倍半萜烯（瓦伦烯）信号；以经典GC-MS分析为基准，比较不同培养规模（瓶子、24深孔板、96深孔板）下突变体的产量排名，验证PTR-MS作为高通量筛选工具的可行性。
研究路线图
核心内容
本研究开发了一种基于质子转移反应质谱（PTR-Qi-ToF-MS）的高通量筛选方法，用于从萜烯合酶突变体文库中快速鉴定高产菌株。该方法将多孔板培养与顶空在线检测相结合，直接测量培养物顶空气中的瓦伦烯信号，省去了传统GC-MS所需的萃取、衍生化等多步样品制备流程，样品前处理步骤从5步减少至2步。以经典GC-MS为基准，作者比较了摇瓶、24深孔板和96深孔板三种培养规模下四个CnVS突变体的产量排名，结果显示两种方法在瓦伦烯产量排序上高度一致（R²>0.95），其中L566S突变体产量最高（GC-MS测得90.9±2.1 mg/L），显著高于野生型（69.4±5.2 mg/L），而L444F未检测到产物。PTR-MS的通量达到每天约1152个样品，远超GC-MS的每天不足60个，同时96孔板与24孔板间的信号相关性R²>0.97。该工作证明PTR-MS结合多孔板培养是一种可靠且高效的萜烯合酶突变体初筛工具，为大规模突变体库的筛选提供了切实可行的技术方案。
创新点
首次将PTR-Qi-ToF-MS用于萜烯合酶突变体的高通量筛选；实现了从250 mL瓶子到96深孔板的规模化培养与顶空在线检测；样品前处理步骤从5步减至2步，单样分析时间大幅缩短，每天可测量约1152个样品（96孔板），远超GC-MS（每天不到60个）。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）途径 | pBbE5k-MevT(CO)-MBIS(CO)（FDP合成基因簇） | — | 催化 | 宿主菌株，通过质粒表达MVA途径酶以合成法尼基焦磷酸（FDP），作为萜烯合酶底物 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（瓦伦烯） | CnVS | Callitropsis nootkatensis valencene synthase | 催化 | 野生型瓦伦烯合酶，催化FDP环化生成瓦伦烯（约10%的germacrene A副产物） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（瓦伦烯） | CnVS F300Y | CnVS mutant F300Y | 催化 | 第300位苯丙氨酸突变为酪氨酸，产量低于野生型（GC-MS: 57.5 mg/L） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（瓦伦烯） | CnVS L444F | CnVS mutant L444F | 催化 | 第444位亮氨酸突变为苯丙氨酸，功能丧失（未检测到瓦伦烯） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（瓦伦烯） | CnVS L566S | CnVS mutant L566S | 催化 | 第566位亮氨酸突变为丝氨酸，产量最高（GC-MS: 90.9 mg/L） |
关键发现
- PTR-Qi-ToF-MS与GC-MS在瓦伦烯产量排名上具有良好一致性（R²>0.95）
- L566S突变体产量最高（GC-MS测得90.9±2.1 mg/L），野生型CnVS为69.4±5.2 mg/L，F300Y为57.5±0.4 mg/L，L444F未检测到
- 在24和96深孔板中，L566S与CnVS的比值与摇瓶结果相近，但L566S/F300Y和CnVS/F300Y比值更大
- 96深孔板与24深孔板之间的信号相关系数R²>0.97
- PTR-MS方法通量可达1152个样品/天，而GC-MS仅约60个/天。
研究结论
PTR-Qi-ToF-MS结合多孔板培养是一种有前景的萜烯合酶高通量筛选方法，能够在显著缩短分析时间的同时提供与GC-MS一致的突变体活性排名，适用于大规模突变体库的初步筛选，但需进一步实现自动化以提高稳定性。