Cloning and expression of a xylanase xynB from Aspergillus niger IA-001 in Pichia pastoris
- 作者
- Wei Fang, He Gao, Yunhe Cao, Anshan Shan
- 单位
- Institute of Animal Nutrition, Northeast Agricultural University; National Key Laboratory of Animal Nutrition, China Agricultural University
- 杂志
- Journal of Basic Microbiology（2013）
- DOI
- 10.1002/jobm.201300078
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
实现黑曲霉IA-001来源的木聚糖酶基因xynB在毕赤酵母中的高效异源表达，获得高活性、适于工业应用（尤其是动物饲料添加剂）的木聚糖酶。
研究策略
从黑曲霉IA-001克隆xynB基因，通过overlap PCR去除内含子，构建pPICZαA和pPICZαmA（优化α-因子信号肽）表达载体，转化毕赤酵母X-33，经摇瓶筛选和10L发酵罐高密度发酵，再经硫酸铵沉淀和离子交换层析纯化，并系统表征酶学性质。
研究路线图
核心内容
该研究从黑曲霉IA-001中克隆了木聚糖酶基因xynB，通过overlap PCR去除内含子后构建pPICZαA及携带突变α-因子信号肽的pPICZαmA表达载体，转化毕赤酵母X-33实现异源分泌表达。摇瓶水平上，突变信号肽使重组酶活较野生信号肽提高1.5倍，达到1280 U/ml，是原始黑曲霉菌株的19.39倍；经10L发酵罐高密度发酵诱导114 h后，酶活最高达10035 U/ml。纯化后重组酶比活为1916 U/mg，分子量约24 kDa，最适pH 5.0、最适温度50°C，且在pH 2.2–10.0宽范围内保持超过88%的活性，Mg²⁺可将酶活增强至132.48%。该研究证明突变α-因子信号肽能有效提升毕赤酵母分泌效率，所获重组木聚糖酶兼具高产量、宽pH稳定性和良好金属离子耐受性，具备作为动物饲料添加剂的工业应用潜力。
创新点
采用定向进化得到的突变α-因子信号肽（pPICZαmA）使木聚糖酶分泌活性较野生信号肽提高1.5倍；在10L发酵罐中实现了10035 U/ml的高水平酶活；重组木聚糖酶具有宽pH稳定性（2.2–10.0）和良好金属离子耐受性，适合饲料工业应用。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris X-33 | 木聚糖降解 | xynB | GH11木聚糖酶 | 催化 | 重组木聚糖酶，水解木聚糖β-1,4-糖苷键 |
| Pichia pastoris X-33 | 分泌途径 | α-factor信号肽（突变体） | — | 转运 | 优化后的α-因子信号肽引导蛋白分泌，提高表达1.5倍 |
| Pichia pastoris X-33 | 甲醇代谢 | AOX1 | 醇氧化酶I | 调控 | AOX1启动子驱动外源基因表达 |
| Aspergillus niger IA-001 | 木聚糖降解 | xynB | 木聚糖酶 | 催化 | 目的基因来源菌株 |
关键发现
- 摇瓶水平重组酶活达1280 U/ml，比pPICZαA表达高1.5倍，比原始黑曲霉菌株高19.39倍
- 10L发酵罐诱导114 h后酶活达10035 U/ml
- 纯化后比活为1916 U/mg，蛋白含量6.47 mg/ml，SDS-PAGE显示分子量24 kDa
- 最适pH为5.0，最适温度50°C，在pH 2.2–10.0范围内保持>88%活性
- Km为4.429 mg/ml，Vmax为1429 U/mg
- Mg2+使活性增强至132.48%，Hg2+抑制至63.76%。
研究结论
重组木聚糖酶xynB在毕赤酵母中实现了高水平分泌表达，酶学性质优良（宽pH稳定性、适温、高比活），具有工业应用潜力，尤其适用于动物饲料添加剂领域。