Sample preparation workflow for the liquid chromatography tandem mass spectrometry based analysis of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate cofactors in yeast
- 作者
- Karin Ortmayr, Justyna Nocon, Brigitte Gasser, Diethard Mattanovich, Stephan Hann, Gunda Koellensperger
- 单位
- 自然资源与生命科学大学化学系，维也纳；自然资源与生命科学大学（BOKU）生物技术系，维也纳；奥地利工业生物技术中心（ACIB），维也纳；维也纳大学化学学院分析化学研究所，维也纳
- 杂志
- Journal of Separation Science（2014）
- DOI
- 10.1002/jssc.201400290
- 所属领域
- 分析化学
- 关键词
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解决的核心问题
准确量化酵母细胞中不稳定的氧化型（NADP+）和还原型（NADPH）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是分析化学的难题，其比值具有重要生物学意义，但样品制备中易发生降解或氧化，导致测量偏差。
研究策略
系统评估了四种典型代谢物提取方法（冷冻-解冻、玻璃珠机械裂解、沸腾乙醇提取、热水提取）对NADP+和NADPH的回收率与提取效率，优化了色谱分离条件，采用pH 8.0的5 mM乙酸铵作为提取溶剂和流动相，结合100%可湿润反相固定相（Atlantis T3）和串联质谱检测，建立了无需内标的相对定量工作流程。
研究路线图
核心内容
针对酵母中氧化型（NADP+）和还原型（NADPH）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在样品制备中易降解或氧化、导致测量偏差的问题，本研究系统评估了冷冻-解冻、玻璃珠机械裂解、沸腾乙醇及热水提取四种代谢物提取方法，并优化了色谱分离条件。实验采用pH 8.0的5 mM乙酸铵作为提取溶剂和流动相，结合Atlantis T3反相固定相和串联质谱检测，建立了无需内标的相对定量工作流程。该法可在12分钟内实现两种辅因子的良好分离（分离度4.9），LC-MS/MS检测限为NADP+ 0.04 pmol、NADPH 0.15 pmol，峰面积RSD分别低至3.4%和4.5%。稳定性实验显示，pH 4.0下8小时后NADPH信号剩余不足20%，而pH 8.0下NADPH回收率达104±4%、NADP+为95–103%，证实碱性条件可显著避免降解。对比发现，冷冻-解冻法的干燥步骤造成NADP+和NADPH分别损失约35%和50%，而85°C热水提取表现出最佳稳定性。将该方法应用于野生型X-33与过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的ZWF1菌株，结果显示野生型NADPH占NADP池的比例为0.15，ZWF1升至0.41，野生型NADP池总量约0.92 nmol，ZWF1为0.66 nmol，差异达1.4倍，能够清晰区分不同菌株的还原状态。该流程无需内标即可获得良好重复性，并为未来引入同位素稀释实现绝对定量奠定了基础。
创新点
建立了针对NADP+和NADPH的专属LC-MS/MS分析方法，实现两种辅因子在12分钟内良好分离（分离度4.9）；通过系统优化发现pH 8.0缓冲液中85°C热水提取可同时保证两者稳定，避免了溶剂干燥步骤带来的约50%损失；在不使用内标的情况下获得了优异的生物学重复性（平均<10%）。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris X-33（野生型） | 磷酸戊糖途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH） | 催化 | 催化NADP+还原为NADPH，在野生型中正常表达 |
| Pichia pastoris ZWF1（过表达G6PDH菌株） | 磷酸戊糖途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH） | 催化 | 过表达该基因导致NADPH/NADP+比例显著升高 |
关键发现
- 在反相色谱中NADP+和NADPH的分离度为4.9，LC-MS/MS检测限为NADP+
- 04 pmol、NADPH
- 15 pmol；峰面积RSD（N=5）在LC-MS/MS上为NADP+
- 4%、NADPH
- 5%。标准稳定性实验表明，pH
- 0下8小时后NADPH信号剩余不足20%，而pH
- 0下NADPH回收率104±4%，NADP+回收率95–103%。冷冻-解冻法干燥步骤导致NADP+回收率65.2±0.2%、NADPH
- 8±1.3%；玻璃珠法第一次匀浆后NADP+回收80.8±4.4%、NADPH
- 1±3.4%。热水提取和沸腾乙醇在85°C下均稳定，但溶剂去除带来约50%损失。应用该方法比较野生型X-33与过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的ZWF1菌株，野生型还原荷电度（NADPH占NADP池比例）为0.15±<0.01，ZWF1为0.41±0.04；野生型NADP池总量约0.92 nmol，ZWF1为0.66 nmol，相差1.4倍；野生型NADPH和NADP+重复性分别为0.7%和0.4%，ZWF1分别为8.4%和27%。
研究结论
建立了适用于酵母细胞中NADP+和NADPH相对定量的完整分析流程（热水提取、pH 8.0缓冲液、RPLC-MS/MS），无需内标即可获得良好重复性，并能区分不同菌株间的NADP还原状态差异。未来需引入同位素稀释策略以实现绝对定量。