Metabolic Engineering for the Production of Copolyesters Consisting of 3-Hydroxybutyrate and 3-Hydroxyhexanoate by Aeromonas hydrophila

作者: Yuan-Zheng Qiu, Shao-Ping Ouyang, Zhongyao Shen, Qiong Wu, Guo-Qiang Chen
单位: 清华大学生物科学与生物技术系；清华大学化学工程系
杂志: Macromolecular Bioscience（2004）
DOI: 10.1002/mabi.200300090
所属领域: 代谢工程
关键词: Aeromonas hydrophilabiopolymersmetabolic engineeringpoly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)polyesters
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解决的核心问题

野生型嗜水气单胞菌4AK4合成的PHBHHx中3HHx摩尔分数通常高于12%，无法获得低于10%的3HHx组分，而低3HHx的PHBHHx更适合热塑加工和特定应用。需要调控PHBHHx中3HHx的比例至10%以下，并提高产量。

研究策略

将Ralstonia eutropha的phbA和phbB基因导入Aeromonas hydrophila 4AK4，构建额外的3HB-CoA前体供给途径；以葡糖酸作为共底物，通过改变葡糖酸浓度调控3HB与3HHx的比例；同时引入Vitreoscilla血红蛋白基因vgb，改善低氧条件下的生长和PHBHHx合成效率。

研究路线图

100%

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核心内容

针对野生型嗜水气单胞菌4AK4合成的PHBHHx共聚酯中3HHx摩尔分数偏高、难以低于10%的问题，本研究通过代谢工程手段对该菌株进行改造。研究将Ralstonia eutropha的phbA和phbB基因导入4AK4，构建了额外的3HB-CoA前体供给途径，并以葡糖酸作为共底物调控单体比例，同时引入透明颤菌血红蛋白基因vgb以改善低氧条件下的生长和合成效率。结果显示，重组菌pTG01以月桂酸为碳源时PHBHHx含量达46.75 wt%（含12.29 mol% 3HHx），添加8 g/L葡糖酸后含量升至50.65 wt%而3HHx降至5.71 mol%，12 g/L葡糖酸时进一步降至2.80 mol%。含vgb的菌株pVGAB在摇瓶中PHBHHx含量达48.2 wt%，较野生型提高约45%；5 L发酵罐中pVGAB在月桂酸/葡糖酸1:1时产率达到0.475 g/L/h，转化效率0.333 g/g，均优于不含vgb的菌株。该研究实现了3HHx组分在3–12 mol%范围内的可控调节，同时提高了产量和产率，表明改造后的非致病性4AK4菌株具备良好的工业应用潜力。

创新点

首次在A. hydrophila中通过引入phbA和phbB基因构建了3HB-CoA补充合成途径；系统研究了葡糖酸浓度对PHBHHx单位组成的调控作用，实现了3HHx分数在3-12 mol%范围内可控；引入vgb基因显著提高了PHBHHx含量和生产效率。

研究对象（5）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Aeromonas hydrophila 4AK4	PHBHHx生物合成（3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯）	phbA	β-酮硫解酶（β-ketothiolase）	催化	来自Ralstonia eutropha，导入后增强乙酰CoA到3HB-CoA的前体供给
Aeromonas hydrophila 4AK4	PHBHHx生物合成	phbB	乙酰乙酰CoA还原酶（acetoacetyl-CoA reductase）	催化	来自Ralstonia eutropha，与PhbA共同作用将乙酰CoA转化为3HB-CoA
Aeromonas hydrophila 4AK4	PHBHHx生物合成	vgb	透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin）	能量供给	改善微氧条件下的有氧呼吸，促进PHBHHx合成效率
Aeromonas hydrophila 4AK4	PHBHHx生物合成	phaC	PHA合酶（PHA synthase）	催化	内源性PHA合酶，催化3HB-CoA和3HHx-CoA聚合
Aeromonas hydrophila 4AK4	PHBHHx生物合成	phaJ	(R)-特异性烯脂酰CoA水合酶（(R)-specific enoyl-CoA hydratase）	催化	内源酶，参与β-氧化中间产物向3HHx-CoA的转化

关键发现

野生型A. hydrophila 4AK4以月桂酸为碳源时产PHBHHx
64 wt%（含16.85 mol% 3HHx），添加8 g/L葡糖酸后降至20.61 wt%（13.84 mol% 3HHx）。重组菌(pTG01)以月桂酸为碳源时PHBHHx含量为46.75 wt%（12.29 mol% 3HHx），添加8 g/L葡糖酸后含量升至50.65 wt%而3HHx降至5.71 mol%，12 g/L葡糖酸时3HHx进一步降至2.80 mol%。含vgb的重组菌(pVGAB)在摇瓶中PHBHHx含量达48.2 wt%，较野生型(33.2 wt%)和pTG01(38.0 wt%)分别提高约45%和27%，PHBHHx浓度1.71 g/L。5 L发酵罐中，野生型在月桂酸中42 h产PHBHHx
6 wt%（14.4 mol% 3HHx），CDW
4 g/L；pTG01在月桂酸中产51.0 wt%（8.7 mol% 3HHx），月桂酸/葡糖酸1:1时3HHx降至6.7 mol%，1:2时降至4.5 mol%；pVGAB在1:1时PHBHHx产率达0.475 g/L/h，月桂酸到PHBHHx的转化效率为0.333 g/g，均高于无vgb的pTG01（0.355 g/L/h和0.284 g/g）。

研究结论

通过表达外源phbA、phbB和vgb基因，并利用葡糖酸作为共底物，成功实现了PHBHHx中3HHx组分在3-12 mol%范围内的调控，同时提高了PHBHHx含量和产率。非致病性A. hydrophila 4AK4具有生长健壮、营养需求简单和易于基因操作等优点，有望发展成工业应用菌株。