Bioproduction of baccatin III, an advanced precursor of paclitaxel, with transgenic Flammulina velutipes expressing the 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyl transferase gene
- 作者
- Fei Han, Lin-Zhi Kang, Xian-Lu Zeng, Zhi-Wei Ye, Li-Qiong Guo, Jun-Fang Lin
- 杂志
- Journal of the Science of Food and Agriculture（2014）
- DOI
- 10.1002/jsfa.6562
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用可食用真菌金针菇异源表达红豆杉DBAT基因，实现从10-脱乙酰巴卡亭III（10-DAB）生物转化生产巴卡亭III，为紫杉醇前体的半合成提供生物催化途径。
研究策略
构建含有金针菇内源gpd启动子和红豆杉DBAT基因的表达载体pgFvs-TcDBAT，通过PEG介导的原生质体共转化导入金针菇，以潮霉素B筛选转化子，通过PCR、Southern blot、RT-PCR、酶活检测和HPLC分析验证外源基因的整合、表达和产物生成。
核心内容
该研究首次在食用菌金针菇中异源表达了来自红豆杉的10-脱乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰转移酶（DBAT）基因，构建了从10-脱乙酰巴卡亭III（10-DAB）生物转化生成巴卡亭III的真菌系统。研究者利用金针菇内源gpd启动子驱动红豆杉DBAT基因，通过PEG介导的原生质体共转化导入宿主，以潮霉素B筛选转化子。结果显示原生质体平均产量为(1.5±0.1)×10^8，Southern blot证实DBAT以1-3个拷贝整合入基因组，RT-PCR检测到转录且转化子传代5代后仍具有潮霉素抗性稳定性。HPLC分析表明转化子粗酶液在含400 μM 10-DAB和乙酰CoA的反应中催化生成保留时间7.65 min的巴卡亭III产物，而非转化株无此产物。该工作证明食用菌可作为低成本、可规模化的异源表达宿主生产紫杉醇关键前体，为紫杉醇半合成提供了新的生物催化途径。
创新点
首次在食用菌金针菇中表达紫杉醇生物合成基因DBAT；建立了从10-DAB到巴卡亭III的真菌生物转化系统；利用金针菇作为低成本、可大规模培养的异源表达宿主。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Flammulina velutipes | 紫杉醇生物合成途径 | DBAT | 10-脱乙酰巴卡亭III-10-β-O-乙酰转移酶 | 催化 | 来自Taxus chinensis var. mairei，催化10-DAB乙酰化生成巴卡亭III |
| Flammulina velutipes | 抗性筛选 | hph | 潮霉素B磷酸转移酶 | 催化 | 作为共转化筛选标记，来源于Streptomyces hygroscopicus |
关键发现
- 原生质体平均产量为(1.5±0.1)×10^8，在含0.6 mol L⁻¹ KCl的PDA上再生频率为2.27%±0.07%，在含30 μg mL⁻¹潮霉素B时再生频率为0.003%
- PCR检测显示9/20（45%）的转化子含有DBAT基因
- Southern blot证实DBAT基因以1-3个拷贝整合入金针菇基因组
- RT-PCR检测到DBAT转录
- 转化子传代5代后仍能在100 μg mL⁻¹潮霉素B下稳定生长
- HPLC分析显示转化子粗酶液在含400 μM 10-DAB和400 μM乙酰CoA的反应中催化生成巴卡亭III，产物保留时间为7.65 min，非转化株无此产物。
研究结论
DBAT基因可在金针菇中功能表达，转基因金针菇能产生巴卡亭III，这是首次在食用菌中表达紫杉醇生物合成基因，为紫杉醇及其前体的生物生产迈出重要一步。