Protein engineering of Saccharomyces cerevisiae transporter Pdr5p identifies key residues that impact Fusarium mycotoxin export and resistance to inhibition
- 作者
- Amanda B. Gunter, Anne Hermans, Whynn Bosnich, Douglas A. Johnson, Linda J. Harris, Steve Gleddie
- 单位
- Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada; Ottawa-Carleton Institute of Biology, University of Ottawa
- 杂志
- MicrobiologyOpen（2016）
- DOI
- 10.1002/mbo3.381
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定并改造能够输出禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）产生的单端孢霉烯族毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其乙酰化衍生物15A-DON的转运蛋白，以开发作物抗镰刀菌策略。
研究策略
利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）敲除菌株系统筛选PDR网络全部11个已知或推定的ABC转运蛋白，确认Pdr5p是主要输出者；随后对Pdr5p关键残基S1360和T1364进行定点饱和突变（各19种单氨基酸替换，共38个突变体），在Δpdr5菌株中表达，并测定其对DON/15A-DON的输出能力以及对FK506、enniatin B和F. avenaceum培养滤液的抗性。
研究路线图
核心内容
该研究围绕禾谷镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物15A-DON的转运输出问题展开。作者利用酿酒酵母PDR网络全部11个敲除菌株逐一评估各ABC转运蛋白的功能，确认Pdr5p是唯一能高效输出这两种毒素的蛋白，Δpdr5菌株在125 μg/mL DON或25 μg/mL 15A-DON下生长几乎完全受抑。随后对Pdr5p的S1360和T1364两个关键残基进行定点饱和突变，构建了38个单氨基酸替换突变体并测定其毒素输出能力和抑制剂抗性。结果显示，除S1360F、S1360W和T1364D外，其余突变体均维持高水平毒素输出；在FK506和enniatin B存在下，多个突变体如S1360D/E/K、T1364K等表现出显著优于野生型的生长。尤其在Fusarium avenaceum培养滤液加15A-DON的条件下，S1360D、S1360E、S1360K和T1364K仍能维持毒素输出。这些结果说明，通过定点突变可在不牺牲转运功能的前提下降低Pdr5p对抑制剂的敏感性，为作物镰刀菌抗性改良提供了有潜力的候选基因资源。
创新点
首次系统评估PDR网络所有ABC转运蛋白对DON和15A-DON的输出功能；对S1360和T1364残基构建了38个单氨基酸突变体，发现特定突变（如S1360D/E/K、T1364K）可在保持毒素输出的同时抵抗抑制剂，为植物抗性改良提供了候选基因。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | PDR网络（pleiotropic drug resistance network） | PDR5 | Pdr5p | 转运 | 主要输出DON和15A-DON；本研究对其S1360和T1364残基进行定点突变 |
| Saccharomyces cerevisiae Δpdr5（BY4741衍生） | PDR网络 | PDR5变体（S1360X, T1364X） | Pdr5p变体 | 转运 | 38个单氨基酸替换突变体，用于筛选保持毒素输出且抵抗抑制剂的变体 |
| Saccharomyces cerevisiae（相应YKO敲除菌株） | PDR网络 | SNQ2, YOR1等10个已知/推定ABC转运蛋白基因 | Snq2p, Yor1p等 | 转运 | 经表型筛选确认不参与DON和15A-DON输出 |
| Fusarium avenaceum FaLH27 | 次生代谢产物合成 | 未指定 | 未指定 | 催化 | 产生enniatin等Pdr5p抑制剂，用于制备培养滤液测试突变体抗性 |
关键发现
- Pdr5p是PDR网络中唯一能输出DON和15A-DON的转运蛋白
- Δpdr5菌株在DON（125 μg/mL）或15A-DON（25 μg/mL）下生长几乎完全受抑。38个突变体中，除S1360F、S1360W、T1364D外，其余均维持高水平毒素输出。在FK506（20 μg/mL）存在下，S1360D/H/K/N/Q/Y和T1364E/N/P/Q等突变体保持高生长，而WT被严重抑制
- 在enniatin B（20 μg/mL）下，S1360D/E/K/Y和T1364E/K/P/R等高生长。在F. avenaceum FaLH27培养滤液+15A-DON（50 μg/mL）条件下，S1360D、S1360E、S1360K和T1364K的酵母生长显著优于WT。Pdr5p蛋白相对actin表达量比值范围为0.88至1.45，T1364D表达极低。
研究结论
Pdr5p是酵母中DON和15A-DON的主要输出者；通过对S1360/T1364进行定点突变，可以获得保持毒素输出且对Pdr5p抑制剂不敏感的突变体，特别是S1360D、S1360E、S1360K和T1364K在F. avenaceum培养滤液存在时仍能维持15A-DON输出，有望应用于作物镰刀菌抗性改良。