A synthetic biochemistry system for the in vitro production of isoprene from glycolysis intermediates
- 作者
- Tyler P. Korman, Bobby Sahachartsiri, Dan Li, Jeffrey M. Vinokur, David Eisenberg, James U. Bowie
- 单位
- Department of Chemistry and Biochemistry, UCLA-DOE Institute for Genomics and Proteomics, Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, California
- 杂志
- Protein Science（2014）
- DOI
- 10.1002/pro.2436
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
微生物细胞代谢复杂性导致化学品和燃料生产的产率难以达到经济性要求，尤其是低价值大宗化学品如异戊二烯的生产受到多种因素限制（副反应、产物毒性、慢发酵、分离成本等）。
研究策略
采用体外合成生化策略，重构完整的甲羟戊酸途径，并以糖酵解中间产物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）作为碳源和ATP来源，通过一系列酶（共12个）实现ATP、NADPH、乙酰-CoA等辅因子的供给与循环，最终将PEP高效转化为异戊二烯。
研究路线图
核心内容
该研究构建了一个体外合成生化系统，以糖酵解中间产物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）为碳源和ATP来源，通过重构完整的甲羟戊酸途径并偶联糖酵解模块，实现异戊二烯的高效生产。系统中利用来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的丙酮酸脱氢酶复合物和乳酸乳球菌的NADH氧化酶实现CoA和NAD⁺的循环，同时通过添加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶实现NADPH的原位再生，使所有辅因子均以催化量使用。优化后的系统从PEP出发获得约100%的摩尔产率，从乙酰-CoA出发产率达92.5±6.5%，从丙酮酸出发在NADPH再生条件下产率为99±4.5%，异戊二烯生产速率为214.5 μmol L⁻¹ h⁻¹。CoA和NAD⁺循环8次，NADP⁺循环10次，ADP循环3次。该工作证明体外合成生化策略能够以高转化率将糖酵解中间产物转化为异戊二烯，避免了细胞代谢的副反应和产物毒性等限制，为从葡萄糖到异戊二烯及其他乙酰-CoA衍生化合物的体外生产提供了可行路线，尽管当前产率距工业水平仍有约100倍差距。
创新点
['首次在体外重构完整的甲羟戊酸途径并偶联糖酵解模块，实现从PEP到异戊二烯的近100%摩尔产率', '利用嗜热脂肪土芽孢杆菌（G. stearothermophilus）的丙酮酸脱氢酶复合物（GsPDH）和乳酸乳球菌的NADH氧化酶（LINoxE）实现CoA和NAD+的循环，避免NADH反馈抑制', '通过添加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）实现NADPH原位再生，使所有辅因子（CoA、NAD+、NADP+、ADP）均以催化量使用并循环多次']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 体外无细胞体系 | 糖酵解 | pyk | GsPyK | 能量供给 | 来自Geobacillus stearothermophilus的丙酮酸激酶，催化PEP转化为丙酮酸并产生ATP，为甲羟戊酸途径提供ATP。 |
| 体外无细胞体系 | 丙酮酸脱氢酶系统/甲羟戊酸途径 | E1, E2, E3 | GsPDH | 催化 | 来自G. stearothermophilus的丙酮酸脱氢酶多酶复合物，催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA，同时还原NAD+为NADH。 |
| 体外无细胞体系 | 辅因子循环 | noxE | LINoxE | 调控 | 来自Lactococcus lactis的NADH氧化酶，氧化NADH生成NAD+，防止NADH对GsPDH的反馈抑制；不氧化NADPH，保护还原力。 |
| 体外无细胞体系 | 甲羟戊酸途径 | mvaE | EfTHL-HMGR | 催化 | 来自Enterococcus faecalis的双功能酶，具有乙酰-CoA乙酰转移酶和HMG-CoA还原酶活性，催化乙酰-CoA缩合及HMG-CoA还原为甲羟戊酸。 |
| 体外无细胞体系 | 甲羟戊酸途径 | mvaS | EfHMGS | 催化 | 来自E. faecalis的HMG-CoA合成酶（A110G突变体），催化乙酰-CoA与乙酰乙酰-CoA缩合生成HMG-CoA。 |
| 体外无细胞体系 | 甲羟戊酸途径 | HMG1 | ScHMGR-t | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae的截短HMG-CoA还原酶，补充HMGR活性以增强甲羟戊酸通量。 |
| 体外无细胞体系 | 甲羟戊酸途径 | ERG12 | ScMVK | 催化 | 来自S. cerevisiae的甲羟戊酸激酶，催化甲羟戊酸磷酸化生成5-磷酸甲羟戊酸，消耗ATP。 |
| 体外无细胞体系 | 甲羟戊酸途径 | pmk | SsPMVK | 催化 | 来自Sulfolobus solfataricus的磷酸甲羟戊酸激酶，催化5-磷酸甲羟戊酸磷酸化生成5-二磷酸甲羟戊酸，消耗ATP。 |
| 体外无细胞体系 | 甲羟戊酸途径 | MVD1 | ScMDC | 催化 | 来自S. cerevisiae的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，催化5-二磷酸甲羟戊酸脱羧生成异戊烯基二磷酸（IPP），消耗ATP。 |
| 体外无细胞体系 | 甲羟戊酸途径 | idi | EcIDI | 催化 | 来自Escherichia coli的异戊烯基二磷酸异构酶，催化IPP与二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）的相互转化。 |
| 体外无细胞体系 | 异戊二烯合成 | ispS | PaIspS | 催化 | 来自Populus alba的异戊二烯合酶，催化DMAPP脱焦磷酸生成异戊二烯。 |
| 体外无细胞体系 | 磷酸戊糖途径（NADPH再生） | zwf | G6PDH | 能量供给 | 来自Sigma的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，以葡萄糖-6-磷酸为底物再生NADPH，为甲羟戊酸途径提供还原力。 |
关键发现
- 优化系统从PEP生产异戊二烯达约100%摩尔产率
- 从乙酰-CoA出发产率为89.2±1.1%，使用NADPH再生系统时提高至92.5±6.5%
- 从丙酮酸出发，加入NADPH时产率为96.1±6.6%，使用原位NADPH再生系统时达99±4.5%
- 从PEP出发完全转化（约100%）。异戊二烯生产速率为214.5 μmol L⁻¹ h⁻¹（14.6 mg L⁻¹ h⁻¹）。反应中CoA和NAD+循环8次，NADP+循环10次，ADP循环3次。
研究结论
本研究证明通过体外合成生化方法，利用糖酵解产生的ATP可以驱动甲羟戊酸途径，从PEP高转化率地生产异戊二烯。将本系统与完整糖酵解模块偶联后，有望实现从葡萄糖到异戊二烯及其他乙酰-CoA衍生的异戊二烯类化合物的体外生产。当前产率虽距工业水平（约2 g L⁻¹ h⁻¹）低约100倍，但可通过提高底物浓度、酶量和优化反应条件等途径进一步提升。