Reprogramming chaperone pathways to improve membrane protein expression in Escherichia coli
- 作者
- Brent L. Nannenga, François Baneyx
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of Washington, Seattle, Washington 98195-1750
- 杂志
- Protein Science（2011）
- DOI
- 10.1002/pro.669
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中重组膜蛋白表达量低、易错误折叠，限制膜蛋白结构与功能研究，需要开发提高功能性膜蛋白产量的策略。
研究策略
改造大肠杆菌伴侣蛋白途径：敲除trigger factor基因(tig)消除TF与SRP竞争，过表达SRP基因(ffh/ffs)增强靶向，过表达yidC促进膜蛋白插入和折叠，用多种模式底物评估对膜蛋白表达的影响。
核心内容
本研究系统考察了改造大肠杆菌伴侣蛋白途径对重组膜蛋白表达的影响。以BW25113野生株和Δtig缺陷株为底盘，分别敲除trigger factor基因、过表达SRP组分（ffh/ffs）以及YidC插入酶，并以ZraS、HtdR和pSRII三种膜蛋白为模式底物评估效果。结果显示，TF失活使膜整合蛋白产量提升3至7倍，其中ZraS提高3倍以上、HtdR达2.6倍、pSRII达3.4倍；在野生型中额外共表达YidC可使HtdR产量提高60%、pSRII提高2倍以上；而SRP共表达反而使HtdR和pSRII产量下降约50%，加剧转位瓶颈。最优摇瓶条件下ZraS、pSRII和HtdR产量分别达0.5、4和16 mg/L，在500 mL发酵规模中pSRII和HtdR分别提升至约10和35 mg/L，且Δtig/pYidC组合使pSRII培养密度提高2倍。研究表明TF失活是提升大肠杆菌功能性膜蛋白表达的有效通用策略，YidC过表达对多跨膜蛋白具有协同增益，为膜蛋白结构生物学研究提供了可行的宿主改造方案。
创新点
首次系统比较TF失活、SRP过表达和YidC过表达对膜蛋白表达的影响，证明TF失活和YidC共表达可显著提高膜蛋白产量，而SRP过表达反而有害。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 (tig+) 和 KTD101 (Δtig) | 膜蛋白生物发生（SRP/SecYEG/YidC途径） | tig | Trigger factor (TF) | 调控 | 分子伴侣，与SRP竞争核糖体结合，敲除可提高膜蛋白表达 |
| Escherichia coli BW25113 (tig+) 和 KTD101 (Δtig) | 膜蛋白生物发生（SRP/SecYEG/YidC途径） | ffh, ffs | Signal recognition particle (SRP) | 调控 | 识别并靶向新生跨膜片段至SecYEG，过表达抑制膜蛋白表达 |
| Escherichia coli BW25113 (tig+) 和 KTD101 (Δtig) | 膜蛋白生物发生（SRP/SecYEG/YidC途径） | yidC | YidC | 调控 | 膜蛋白插入酶/伴侣，促进多跨膜蛋白组装与折叠 |
| Escherichia coli BW25113 (tig+) 和 KTD101 (Δtig) | 膜蛋白生物发生（SRP/SecYEG/YidC途径） | secY, secE, secG | SecYEG translocon | 转运 | 蛋白质跨膜转运通道，膜蛋白共翻译插入的场所 |
| Escherichia coli BW25113 (tig+) 和 KTD101 (Δtig) | 膜蛋白生物发生（SRP/SecYEG/YidC途径） | ftsY | FtsY | 调控 | SRP受体，将核糖体新生链复合物对接至SecYEG |
| Escherichia coli BW25113 (tig+) 和 KTD101 (Δtig) | 膜蛋白生物发生（SRP/SecYEG/YidC途径） | zraS | ZraS | 催化 | 锌/铅双组分系统组氨酸激酶，含2个跨膜螺旋，作为模型底物 |
| Escherichia coli BW25113 (tig+) 和 KTD101 (Δtig) | 膜蛋白生物发生（SRP/SecYEG/YidC途径） | htdR | HtdR (deltarhodopsin) | 转运 | 光驱动质子泵，含7个跨膜螺旋，作为模型底物 |
| Escherichia coli BW25113 (tig+) 和 KTD101 (Δtig) | 膜蛋白生物发生（SRP/SecYEG/YidC途径） | pSRII | pSRII (sensory rhodopsin II) | 调控 | 负趋光性光感受器，含7个跨膜螺旋，作为模型底物 |
关键发现
- 使用TF缺陷(Δtig)菌株使膜整合蛋白产量提高3-7倍：ZraS提高>3倍、HtdR提高2.6倍、pSRII提高3.4倍
- YidC共表达在野生型中使HtdR产量提高60%、pSRII提高>2倍
- SRP共表达使HtdR和pSRII产量降低约50%
- 最佳摇瓶产量ZraS 0.5 mg/L、pSRII 4 mg/L、HtdR 16 mg/L
- 500 mL规模中pSRII产量约10 mg/L、HtdR约35 mg/L
- Δtig/pYidC使pSRII培养密度提高2倍。
研究结论
TF失活是提高大肠杆菌膜蛋白表达的有效手段，YidC过表达对多跨膜蛋白有益，而SRP过表达会加重转位瓶颈。该策略可显著提高功能性膜蛋白产量，为膜蛋白结构生物学提供可行方法。