Serial increase in the thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Bacillus subtilis by experimental evolution
- 作者
- SATOSHI AKANUMA, AKIHIKO YAMAGISHI, NOBUO TANAKA, TAIRO OSHIMA
- 单位
- Department of Molecular Biology, Tokyo University of Pharmacy and Life Science, Horinouchi, Hachioji 192-03, Japan; Department of Life Science, Tokyo Institute of Technology, Nagatsuta, Midori-ku, Yokohama 226, Japan
- 杂志
- Protein Science（1998）
- DOI
- 10.1002/pro.5560070319
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
枯草芽孢杆菌3-异丙基苹果酸脱氢酶(IPMDH)热稳定性差，在高温下易失活，需要在不依赖三维结构信息的情况下提高其热稳定性。
研究策略
利用体内进化技术，以极端嗜热菌Thermus thermophilus为宿主，将B. subtilis的leuB基因整合到其leuB缺陷菌株染色体上，以亮氨酸自养为选择压力，逐步提高筛选温度（61→66→70°C）从自发突变中筛选热稳定性提高的突变体。
研究路线图
核心内容
该研究以极端嗜热菌Thermus thermophilus为宿主，通过体内进化策略逐步提高枯草芽孢杆菌3-异丙基苹果酸脱氢酶（IPMDH）的热稳定性。作者将B. subtilis的leuB基因整合至T. thermophilus的leuB缺陷菌株染色体上，以亮氨酸自养为选择压力，将筛选温度从61°C逐步提升至66°C和70°C，从自发突变中连续筛选出三个累加突变T308I、I95L和M292I。结果显示，单突变T308I使半失活温度提高4.5°C，双突变I95L/T308I提高8.0°C，而三突变体I95L/M292I/T308I整体提高10.0°C，并在70°C时保持野生型3.4倍的活性。三突变体的最适温度升至65°C，较野生型的60°C更高，同时其Km(NAD)降至241 μM，kcat升至26.0 s⁻¹，整体催化效率优于野生型。热变性分析表明突变主要稳定结构域1。值得注意的是，T308I对应的残基在T. thermophilus同源蛋白中为组氨酸而非异亮氨酸，说明稳定化并不必然要求替换为嗜热菌对应残基。该工作验证了以极端嗜热菌为宿主的体内进化是提升中温酶热稳定性的有效通用策略。
创新点
①不依赖蛋白质三维结构信息，通过体内进化技术实现中温酶的热稳定性提升；②通过逐步升温连续筛选获得三个累加点突变，热稳定性呈阶梯式增加；③发现突变T308I对应的残基与嗜热菌同源蛋白中的残基不同（T. thermophilus为His），表明稳定化不必然要求替换为嗜热菌对应的残基。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Thermus thermophilus MT106 | 亮氨酸生物合成 | Bacillus subtilis leuB | 3-异丙基苹果酸脱氢酶(IPMDH) | 催化 | 外源leuB基因整合至染色体，用于体内进化筛选 |
| Escherichia coli JA221 | 亮氨酸生物合成 | leuB（野生型及突变体） | 3-异丙基苹果酸脱氢酶(IPMDH) | 催化 | 用于重组表达和酶学表征 |
| Thermus thermophilus MT106 | 亮氨酸生物合成 | leuB（含T308I/I95L/M292I突变） | IPMDH突变体 | 催化 | 通过逐步升温筛选获得，半失活温度相对野生型提高10°C |
关键发现
- 获得三个逐步氨基酸替换：T308I、I95L、M292I，使菌株在70°C下仍能亮氨酸自养生长
- 半失活温度相对野生型提高：T308I提高4.5°C，I95L/T308I提高8.0°C，三突变体I95L/M292I/T308I提高10.0°C
- 单突变I95L提高5.0°C，M292I提高2.0°C
- 三突变体在70°C时活性为野生型的3.4倍，40°C时为1.3倍
- 其最适温度略高，最大值在65°C时为野生型60°C时的2倍
- 三突变体Km(NAD)为241 μM（野生型333 μM），kcat为26.0 s^-1（野生型21.2 s^-1）
- M292I使Km(D-3-IPM)和Km(NAD)均降至野生型的0.75倍（22.6 μM vs 30.5 μM
- 248 μM vs 333 μM），而I95L使两者升高至1.6-1.9倍
- 热变性呈双相曲线，三个突变主要稳定第一相（结构域1）。
研究结论
通过连续多轮在体内进化筛选，成功使B. subtilis IPMDH的热稳定性显著提高，三突变体在高温下的活性和稳定性均优于野生型，验证了利用极端嗜热菌作为宿主的体内进化策略是提高中温酶热稳定性的有效途径。