Elucidation of biosynthetic pathways of natural products
- 作者
- Shinji Kishimoto, Yuta Tsunematsu, Michio Sato, Kenji Watanabe
- 单位
- University of Shizuoka
- 杂志
- The Chemical Record（2017）
- DOI
- 10.1002/tcr.201700015
- 所属领域
- 合成生物学 / 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析真菌来源复杂天然产物的生物合成途径，特别是氧化酶（P450和FMO）在形成复杂结构中的作用；同时解决天然产物产量低、难以培养等问题。
研究策略
结合基因组挖掘、基因敲除、异源重构（使用酿酒酵母、黑曲霉、构巢曲霉）和体外酶学表征，对目标生物合成途径进行重构和酶功能鉴定，以阐明反应顺序和机制。
核心内容
该研究系统解析了多种真菌来源复杂天然产物的生物合成途径，重点聚焦氧化酶在构建复杂结构中的催化作用。研究者综合运用基因组挖掘、基因敲除、异源重构及体外酶学表征，在酿酒酵母、黑曲霉、构巢曲霉和大肠杆菌等不同宿主中对目标途径进行功能鉴定。通过异源表达，spirotryprostatin A在黑曲霉中产量达1.0 mg/L，较原始菌株提高约330倍，tryprostatin B在酿酒酵母中产量为35.6 mg/L，提高约100倍。研究揭示了多项新催化机制：FMO酶Fq2B催化螺环形成，双加氧酶AsqJ兼具脱氢和环氧化功能，CghA作为可能的Diels-Alderase参与Sch 210972合成，PsoF则是催化甲基化、环氧化及顺反异构化的三功能融合蛋白。此外，膜结合萜环化酶Fma-TC可在酿酒酵母中从头生产β-trans-bergamotene。结果表明异源宿主选择对真菌次级代谢途径解析至关重要：丝状真菌更适合功能性氧化酶表达，大肠杆菌则适用于体外酶制备，为不可培养微生物天然产物的发掘与高效生物生产平台构建提供了策略基础。
创新点
发现FMO（Fq2B）催化螺环形成、双功能双加氧酶AsqJ催化脱氢和环氧化、CghA作为可能的Diels-Alderase、独立硫酯酶PynI参与四甲酸形成、PynH作为脱水酶、膜结合萜环化酶Fma-TC、以及三功能融合蛋白PsoF（甲基转移酶-FMO）等新型酶和催化机制。
研究对象（27）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus niger A1179 | spirotryprostatin biosynthesis | fq2B | Fq2B | 催化 | FMO，催化环氧化-频哪醇重排形成螺环碳；来自fumiquinazoline基因簇，异源表达使1产量达1.0 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | spirotryprostatin biosynthesis | ftmG | FtmG | 催化 | P450，催化自由基介导的羟基化-频哪醇重排形成spirotryprostatin B螺环 |
| Aspergillus nidulans A1149 | viridicatin biosynthesis | asqK | AsqK | 催化 | 双模块NRPS，缩合邻氨基苯甲酸与芳香氨基酸，生成苯二氮卓类中间体 |
| Escherichia coli | viridicatin biosynthesis | asqJ | AsqJ | 催化 | α-酮戊二酸依赖双加氧酶，双功能，催化脱氢和环氧化反应 |
| Aspergillus nidulans A1145 | Sch 210972 biosynthesis | cghG | CghG | 催化 | PKS-NRPS杂合酶，合成线性聚酮底物和四甲酸部分 |
| Chaetomium globosum | Sch 210972 biosynthesis | cghB | CghB | 催化 | 醛缩酶，催化两分子丙酮酸缩合生成γ-羟甲基-L-谷氨酸前体 |
| Chaetomium globosum | Sch 210972 biosynthesis | cghC | CghC | 催化 | 反式烯酰还原酶，还原聚酮骨架双键 |
| Aspergillus nidulans A1145 | Sch 210972 biosynthesis | cghA | CghA | 催化 | 推测的Diels-Alderase，控制环化立体选择性，使11成为唯一产物 |
| Aspergillus niger A1179 | pyranonigrin biosynthesis | pynA | PynA | 催化 | PKS-NRPS杂合酶，负责线性中间体合成 |
| Aspergillus niger A1179 | pyranonigrin biosynthesis | pynI | PynI | 催化 | 独立硫酯酶，催化四甲酸形成和链释放 |
| Escherichia coli | pyranonigrin biosynthesis | pynG | PynG | 催化 | FMO，催化环氧化形成γ-吡喃酮环 |
| Saccharomyces cerevisiae | pyranonigrin biosynthesis | pynD | PynD | 催化 | P450，参与γ-吡喃酮环的氧化形成 |
| Aspergillus niger | pyranonigrin biosynthesis | pynC | PynC | 催化 | N-甲基转移酶，甲基化四甲酸部分氮原子 |
| Aspergillus niger | pyranonigrin biosynthesis | pynH | PynH | 催化 | 脱水酶（预测为天冬氨酸蛋白酶样蛋白），催化丝氨酸侧链脱水形成外亚甲基 |
| Escherichia coli | pyranonigrin biosynthesis | pynE | PynE | 催化 | 还原酶，催化14还原为16 |
| Saccharomyces cerevisiae | pyranonigrin biosynthesis | pynB | PynB | 催化 | FMO，可将16氧化回14 |
| Saccharomyces cerevisiae | fumagillin biosynthesis | fma-TC | Fma-TC | 催化 | 膜结合II类萜环化酶，催化FPP环化生成β-trans-bergamotene |
| Saccharomyces cerevisiae | fumagillin biosynthesis | fma-PKS | Fma-PKS | 催化 | 高度还原性聚酮合酶，产生十二碳五烯酸 |
| Saccharomyces cerevisiae | fumagillin biosynthesis | fma-AT | Fma-AT | 催化 | 酰基转移酶，将不饱和脂肪酸转移到21上形成22 |
| Saccharomyces cerevisiae | fumagillin biosynthesis | fma-P450 | Fma-P450 | 催化 | P450，催化三个氧化反应，参与环丁烷桥开环和酮/环氧基安装 |
| Saccharomyces cerevisiae | fumagillin biosynthesis | fma-C6H | Fma-C6H | 催化 | 非血红素Fe(II)/α-酮戊二酸依赖双加氧酶，在C6引入羟基 |
| Saccharomyces cerevisiae | fumagillin biosynthesis | fma-KR | Fma-KR | 催化 | 酮还原酶，还原C5酮基 |
| Saccharomyces cerevisiae | fumagillin biosynthesis | fma-ABM | Fma-ABM | 催化 | ABM超家族氧化酶，催化末端羧酸形成 |
| Saccharomyces cerevisiae | pseurotin biosynthesis | psoE | PsoE | 催化 | 谷胱甘肽S-转移酶，催化GSH与底物共轭，驱动反式-顺式异构化 |
| Saccharomyces cerevisiae | pseurotin biosynthesis | psoF | PsoF | 催化 | 甲基转移酶-FMO融合蛋白，催化C-甲基化和环氧化，并促进异构化完成 |
| Saccharomyces cerevisiae | pseurotin biosynthesis | psoD | PsoD | 催化 | P450，参与pseurotin氧化步骤 |
| Aspergillus fumigatus | fumagillin/pseurotin biosynthesis | fapR | FapR | 调控 | Zn(II)2Cys6转录因子，共同调控两个交织的基因簇 |
关键发现
- 异源表达6个基因使spirotryprostatin A在A. niger中产量达1.0 mg/L，较原始菌株A. fumigatus的0.003 mg/L提高约330倍
- tryprostatin B在S. cerevisiae中产量为35.6 mg/L，较原始菌株提高约100倍
- AsqJ在体外催化8→9→10→3的连续反应，表明其为双功能双加氧酶
- CghA敲除导致Sch 210972产量显著降低并产生非对映异构体13，回补后只生成11
- PynA或PynI敲除完全消除所有pyranonigrins的生成
- Fma-TC在S. cerevisiae中异源表达可从头生产β-trans-bergamotene
- PsoF被鉴定为催化C-甲基化和环氧化及促进顺反异构化的三功能酶。
研究结论
异源宿主的选择对研究真菌次级代谢产物生物合成至关重要：S. cerevisiae操作方便但表达氧化还原酶能力较弱，丝状真菌（A. niger、A. nidulans）更适合功能性P450等氧化酶的表达；E. coli适用于制备体外酶。未来应拓展至不可培养微生物，结合宏基因组学与合成生物学方法开发高效的天然产物发现和生物生产平台。