Elucidating the exact role of engineered CRABPII residues for the formation of a retinal protonated Schiff base
- 作者
- Chrysoula Vasileiou, Wenjing Wang, Xiaofei Jia, Kin Sing Stephen Lee, Camille T. Watson, James H. Geiger, Babak Borhan
- 单位
- Department of Chemistry, Michigan State University, East Lansing, Michigan 48824
- 杂志
- Proteins（2009）
- DOI
- 10.1002/prot.22495
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明工程化CRABPII残基在视黄醛质子化席夫碱形成中的精确作用，特别是Lys132、Tyr134、Arg111和Glu121四个残基在亚胺形成和质子化中的角色。
研究策略
通过定点突变、紫外-可见光谱、质谱（还原胺化）和X射线晶体学系统研究各残基突变对席夫碱形成和质子化的影响，比较突变体的结合亲和力、吸收最大值和pKa值。
研究路线图
核心内容
该研究通过定点突变、紫外-可见光谱、还原胺化质谱及X射线晶体学等手段，系统解析了工程化CRABPII中四个关键残基（Lys132、Tyr134、Arg111、Glu121）在视黄醛质子化席夫碱形成中的精确分工。结果显示，野生型CRABPII结合全反式视黄酸的亲和力为2.0 nM；最佳三重突变体R132K:R111L:L121E能以1.4 nM的高亲和力结合视黄醛并形成质子化席夫碱，λmax为449 nm，pKa为8.7。然而，R132K:Y134F突变体丧失形成席夫碱的能力，但该能力可在Arg111或Glu121同时突变后恢复。晶体结构揭示，Glu121与Tyr134及Arg111分别形成2.7/2.8 Å和2.8 Å氢键，且有序水分子W1、W2协调Arg111。将Arg111替换为Met/Val仍可保持质子化席夫碱形成，而其替换为Glu则完全丧失该能力。研究表明，席夫碱形成需满足三个条件：Lys132正确定位提供亲核攻击、Tyr134或Glu121激活并定位羰基且需移除Arg111介导的水分子、Glu121作为反离子稳定质子化席夫碱。该工作为视黄醛结合蛋白的理性设计提供了精确的分子机制指导。
创新点
系统解析了CRABPII改造中各残基的精确作用，发现Glu121与Arg111的直接相互作用对席夫碱形成和质子化至关重要，并提出了PSB形成的三个必要条件。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)-pLysS | — | CRABPII | 野生型CRABPII | 调控 | 结合全反式视黄酸，亲和力2.0±1.2 nM |
| Escherichia coli BL21(DE3)-pLysS | — | CRABPII | R132K突变体 | 催化 | 引入亲核赖氨酸，能形成席夫碱 |
| Escherichia coli BL21(DE3)-pLysS | — | CRABPII | R132K:Y134F突变体 | 催化 | 失去形成席夫碱能力，Kd=120±5 nM |
| Escherichia coli BL21(DE3)-pLysS | — | CRABPII | R132K:R111L:L121E突变体 | 催化 | 最佳PSB形成突变体，Kd=1.4±4.9 nM，pKa=8.7 |
关键发现
- 野生型CRABPII对全反式视黄酸的结合亲和力为2.0±1.2 nM
- 最佳三重突变体R132K:R111L:L121E以高亲和力（Kd=1.4±4.9 nM）结合全反式视黄醛形成质子化席夫碱，λmax=449 nm，pKa=8.7
- R132K:Y134F突变体失去形成席夫碱的能力（Kd=120±5 nM），但当Arg111或Glu121突变后可恢复
- R132K:L121E形成PSB（λmax=457 nm，pKa=7.8），Arg111的去除使pKa提高约1个单位
- 晶体结构显示apo-R132K:L121E中Glu121与Tyr134形成2.7/2.8 Å氢键，与Arg111形成2.8 Å氢键
- 有序水分子W1（100%占据）和W2（50%占据）协调Arg111
- 用Met/Val替换Arg111仍保持PSB形成（λmax=449 nm，pKa≈8.8-8.9），而Lys/His则降低pKa
- 用Glu替换Arg111导致无法形成席夫碱（Kd=894±120 nM）。
研究结论
研究表明PSB形成需满足三个条件：Lys132正确位置提供亲核；Tyr134或Glu121激活并正确定位羰基，且需移除Arg111介导的水分子；Glu121作为反离子稳定PSB，其去质子化受Tyr134增强，受Arg111或Glu111破坏。