Influence of low glycolytic activities in gcr1 and gcr2 mutants on the expression of other metabolic pathway genes in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Hiromi Sasaki, Hiroshi Uemura
- 单位
- Institute for Biological Resources and Functions, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan
- 杂志
- Yeast（2005）
- DOI
- 10.1002/yea.1198
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析 Gcr1p/Gcr2p 转录因子突变导致的低糖酵解活性如何影响酵母其他代谢通路（尤其是 TCA 循环和呼吸链）的基因表达
研究策略
利用 gcr1 和 gcr2 缺失突变株与野生型酵母进行全基因组 cDNA 微阵列分析，分别在 2% 葡萄糖和 2% 甘油+2% 乳酸条件下比较表达谱；用 RT-PCR 验证代表性基因；通过生长曲线、抗霉素 A 抑制呼吸及葡萄糖/乙醇产量测定验证代谢模式变化
核心内容
本研究通过gcr1和gcr2缺失突变体与野生型酿酒酵母的全基因组cDNA微阵列分析，解析低糖酵解活性对酵母其他代谢通路基因表达的调控影响。在2%葡萄糖条件下，突变体糖酵解基因表达显著下调，如GPM1的log2 ratio分别为-3.62和-3.94，ENO2为-4.64和-2.92；而TCA循环、ATP合成与氧化磷酸化基因则大幅上调，包括CIT1、ACO1、SDH1、ATP1和CYC1等。生理层面，gcr1突变体在葡萄糖中的倍增时间延长至8.4小时（野生型仅1.6小时），gcr2为3.0小时；加入呼吸抑制剂抗霉素A后，gcr2倍增时间进一步延长至4.4小时，gcr1几乎无法生长。葡萄糖利用实验表明，gcr2突变体的生物量转化效率为野生型的1.56倍，乙醇产量降至0.77倍，而gcr1乙醇产量比率为0.48。RT-PCR证实HAP5在突变体中完全去抑制，SIP4部分去抑制。该研究首次揭示低糖酵解通量通过上调HAP5和SIP4介导代谢模式从发酵向呼吸转变，使酵母更高效地将葡萄糖转化为生物量，为代谢工程调控碳流分配提供了关键靶点。
创新点
发现 gcr 突变不仅降低糖酵解基因表达，还在葡萄糖条件下上调 TCA 循环、ATP 合成和氧化磷酸化基因；首次揭示 HAP5 和 SIP4 表达上调介导该代谢重编程；证明低糖酵解通量使细胞从发酵转向呼吸以提高生物量转化效率
研究对象（24）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | GCR1 | Gcr1p | 调控 | 转录激活因子，与 Gcr2p 形成复合物，调控糖酵解基因表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | GCR2 | Gcr2p | 调控 | Gcr1p 的共激活因子，同源二聚体参与高表达激活 |
| Saccharomyces cerevisiae | 呼吸/线粒体 | HAP5 | Hap5p | 调控 | CCAAT 结合转录因子 HAP 复合物亚基，在 gcr 突变体葡萄糖条件下表达完全去抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖异生/葡萄糖代谢 | SIP4 | Sip4p | 调控 | 锌簇转录因子，调控糖异生和 TCA 循环基因，在 gcr 突变体葡萄糖条件下部分去抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | HXK2 | Hxk2p | 催化 | 己糖激酶 PII，催化葡萄糖磷酸化，也参与葡萄糖阻遏调控；在 gcr 突变体中表达变化不大 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | GPM1 | Gpm1p | 催化 | 磷酸甘油酸变位酶，表达在 gcr1/gcr2 突变体中显著下降（log2 比值 -3.62/-3.94） |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | ENO1 | Eno1p | 催化 | 烯醇化酶 I，表达在 gcr1/gcr2 突变体中显著下降（log2 -3.43/-1.94） |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | ENO2 | Eno2p | 催化 | 烯醇化酶 II，表达在 gcr1/gcr2 突变体中显著下降（log2 -4.64/-2.92） |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | TDH1 | Tdh1p | 催化 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶同工酶，在 gcr1 突变体葡萄糖条件下上调（log2 2.79） |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | TDH2 | Tdh2p | 催化 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶同工酶，在 gcr1/gcr2 突变体中下降（log2 -2.36/-1.47） |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | TDH3 | Tdh3p | 催化 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶主要同工酶，表达下降（log2 -1.64/-2.08） |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | PYK1 | Cdc19p | 催化 | 丙酮酸激酶，表达下降（log2 -2.39/-2.47） |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | PGI1 | Pgi1p | 催化 | 磷酸葡萄糖异构酶，表达下降（log2 -1.36 或 -2.06 等） |
| Saccharomyces cerevisiae | TCA循环 | CIT1 | Cit1p | 催化 | 柠檬酸合酶，在 gcr1 突变体葡萄糖条件下上调（log2 3.13） |
| Saccharomyces cerevisiae | TCA循环 | ACO1 | Aco1p | 催化 | 乌头酸酶，在 gcr1 突变体葡萄糖条件下上调（log2 2.21），RT-PCR 验证 |
| Saccharomyces cerevisiae | TCA循环/呼吸链 | SDH1 | Sdh1p | 催化 | 琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基，在 gcr1 突变体葡萄糖条件下上调（log2 2.29） |
| Saccharomyces cerevisiae | TCA循环/呼吸链 | SDH4 | Sdh4p | 催化 | 琥珀酸脱氢酶膜锚定亚基，在 gcr1 突变体葡萄糖条件下上调（log2 2.16） |
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化磷酸化/ATP合成 | ATP1 | Atp1p | 能量供给 | F1 ATP 合酶 α 亚基，在 gcr1 突变体葡萄糖条件下上调（log2 2.42） |
| Saccharomyces cerevisiae | 呼吸链 | CYC1 | Cyc1p | 能量供给 | 细胞色素 c 异构体 1，在 gcr1/gcr2 突变体葡萄糖条件下上调（log2 2.52/2.22） |
| Saccharomyces cerevisiae | 呼吸链 | COX4 | Cox4p | 能量供给 | 细胞色素 c 氧化酶亚基 IV，在 gcr1 突变体葡萄糖条件下上调（log2 1.31） |
| Saccharomyces cerevisiae | 己糖转运 | HXT2 | Hxt2p | 转运 | 己糖转运蛋白（高/中亲和），在 gcr1 突变体葡萄糖条件下下调（log2 -2.33），gcr2 中上调（2.38） |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖异生 | FBP1 | Fbp1p | 催化 | 果糖-1,6-二磷酸酶，在 gcr1/gcr2 突变体葡萄糖条件下上调（log2 1.34/1.17） |
| Saccharomyces cerevisiae | 葡萄糖阻遏信号 | SNF1 | Snf1p | 调控 | 蛋白激酶，在葡萄糖阻遏信号通路中起核心作用；表达未受 gcr 突变影响 |
| Saccharomyces cerevisiae | 葡萄糖传感 | SNF3 | Snf3p | 调控 | 高亲和葡萄糖传感器，表达未受 gcr 突变影响 |
关键发现
- 在葡萄糖条件下，gcr1 和 gcr2 突变体中大多数糖酵解基因表达显著降低，例如 GPM1 的 log2 ratio 分别为 -3.62 和 -3.94，ENO2 为 -4.64 和 -2.92，PGK1 为 -1.92 和 -2.37；而 TCA 循环和呼吸基因上调，如 CIT1 在 gcr1 中为
- 13，ACO1 为
- 21，SDH1 为
- 29，ATP1 为
- 42，CYC1 为
- 52（均为 log2 ratio）。gcr1 突变体在葡萄糖中严重生长缺陷（倍增时间
- 4±0.2 h vs 野生型
- 6±0.1 h），gcr2 为
- 0±0.2 h；加入呼吸抑制剂抗霉素 A 后，gcr2 倍增时间延长至
- 4±0.1 h，gcr1 几乎不生长。葡萄糖利用效率实验中，gcr2 突变体的生物量转化效率（OD增加/葡萄糖消耗）为野生型的
- 56 倍，乙醇产量降低至
- 77 倍；gcr1 的乙醇产量比率为
- 48。RT-PCR 显示 HAP5 表达在 gcr 突变体中完全去抑制（达到野生型在甘油+乳酸盐培养时的水平），SIP4 部分去抑制。微阵列分析共发现 gcr1 Glc 下调 91 基因、上调 121 基因，gcr2 Glc 下调
- 上调 77。
研究结论
gcr1 和 gcr2 突变体因糖酵解活性降低，在葡萄糖生长条件下改变了代谢模式：下调糖酵解基因，同时增强 TCA 循环、ATP 合成和氧化磷酸化基因表达，使葡萄糖利用更偏向呼吸而非发酵，从而更高效地将葡萄糖转化为生物量。该重编程部分由 HAP5 和 SIP4 的上调介导，为代谢工程调控碳代谢流向提供了参考。