A 'Plug and Play' Platform for the Production of Diverse Monoterpene Hydrocarbon Scaffolds in Escherichia coli.
- 作者
- Nicole G. H. Leferink, Adrian J. Jervis, Ziga Zebec, Helen S. Toogood, Sam Hay, Eriko Takano, Nigel S. Scrutton
- 杂志
- ChemistrySelect（2016）
- DOI
- 10.1002/slct.201600563
- 所属领域
- 合成生物学/代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在E. coli中构建灵活的单萜烃骨架生产平台，实现多种单萜化合物的微生物合成。
研究策略
构建两个质粒模块：pMVA（含异源MVA途径和idi）和pGPPSmTC/S（含截短的GPPS和可更换的单萜合酶），通过'即插即用'交换mTC/S基因，共转化后以葡萄糖为底物进行两相发酵生产。
核心内容
该研究在大肠杆菌中构建了一个“即插即用”的单萜烃骨架生产平台。研究者设计了两个质粒模块，其一携带异源甲羟戊酸途径及异戊烯基二磷酸异构酶基因，其二包含截短的香叶基二磷酸合酶和可灵活更换的单萜合酶基因。通过简单交换合酶基因并共转化两个模块，以葡萄糖为底物进行两相发酵，即可快速生产不同单萜产物。利用该平台，研究成功检测到31种单萜，包括线性、单环及双环骨架，其中有多种此前未在工程微生物中报道的化合物。代表性产量包括α-蒎烯和柠檬烯达到约550至600 mg/L有机相，纯度分别达81%和96%，显著高于过往报道；γ-松油烯、桧烯和葑醇等新产物产量分别为197、77和69 mg/L有机相。该平台展示了通过模块化酶更换快速创造结构多样性的能力，为单萜类化合物的微生物合成及后续优化提供了通用基础。
创新点
1. 构建了含37种单萜环化酶/合酶的'即插即用'平台，可快速更换酶；2. 成功生产超过30种单萜，包括多种此前未在工程微生物中报道的骨架；3. 单萜产量达到较高水平（如α-蒎烯和柠檬烯约550-600 mg/L_org）。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 异源MVA途径和内源MEP途径 | — | — | — | 生产底盘菌株 |
| — | 异戊二烯生物合成 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | MVA途径中的关键酶，催化IPP和DMAPP互变 |
| — | 单萜前体合成 | AgtrGPPS2 (截短) | 香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成GPP |
| — | 单萜合成 | SlimS_Ms | (S)-柠檬烯合酶 | 催化 | 产生S-柠檬烯，最高产量之一 |
| — | 单萜合成 | (-)aPinS_Pt | (-)-α-蒎烯合酶 | 催化 | 产生(-)-α-蒎烯，最高产量之一 |
| — | 单萜合成 | GerS_Pc | 香叶醇合酶 | 催化 | 产生香叶醇，使香叶醇产量达350 mg/L_org |
关键发现
- 检测到31种单萜（11线性、7单环、13双环）
- 16个目标产物被至少一种mTC/S产生，20个mTC/S产生预测主要产物
- 新化合物产量：γ-松油烯197 mg/L_org、葑醇69 mg/L_org、α-松油醇38 mg/L_org、桧烯77 mg/L_org、(E)-β-罗勒烯57 mg/L_org、莰烯12 mg/L_org、β-水芹烯7.4 mg/L_org、萜品油烯3.4 mg/L_org
- 最高产量α-蒎烯和S-柠檬烯约550-600 mg/L_org，纯度分别为81%和96%，超过此前报道（pinene 32 mg/L_org, limonene 435 mg/L_org）
- 芳樟醇0.8 mg/L_org高于酵母的0.1 mg/L
- 主要产物占比30-99%
- 香叶醇副产物在低产时>140 mg/L_org，有香叶醇合酶时350 mg/L_org。
研究结论
该'即插即用'平台能够从葡萄糖生产超过30种单萜烃骨架，展示了合成生物学在快速创造结构多样性方面的潜力，为后续优化和规模化生产奠定了基础。