Fed-batch methanol feeding strategy for recombinant protein production by Pichia pastoris in the presence of co-substrate sorbitol
- 作者
- Eda Celik, Pinar Çalık, Stephen G. Oliver
- 单位
- Middle East Technical University; University of Cambridge
- 杂志
- Yeast（2009）
- DOI
- 10.1002/yea.1679
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在甲醇诱导阶段使用山梨醇作为共底物时，如何优化甲醇流加策略以提高重组蛋白产量、降低氧需求并减少副产物积累。
研究策略
在Pichia pastoris (Mut+)的诱导阶段批式添加50 g/L山梨醇作为非抑制性共底物，结合不同甲醇流加速率（μ0=0.02、0.03、0.04 h-1）进行补料分批发酵，系统考察细胞生长、重组人促红细胞生成素（rHuEPO）生产、醇氧化酶活性、蛋白酶活性、有机酸和氨基酸分泌、氧传递特性及产率系数。
核心内容
本研究以巴斯德毕赤酵母Mut+菌株为宿主，在甲醇诱导阶段批式添加50 g/L山梨醇作为共底物，结合三种甲醇流加速率（μ₀=0.02、0.03、0.04 h⁻¹）进行补料分批发酵，系统考察了重组人促红细胞生成素（rHuEPO）生产、细胞生长、醇氧化酶及蛋白酶活性、有机酸和氨基酸分泌及氧传递特性。结果表明，山梨醇的添加使rHuEPO产量在24小时达到130 mg/L，而单纯甲醇仅为80 mg/L；在t=18 h时，中高流速条件下rHuEPO浓度比对照组高1.7至1.8倍。细胞浓度在24小时即达70 g CDW/L，而对照组需54小时才达80 g CDW/L。最大氧摄取率降低约2倍，特异性蛋白酶浓度从3.06降至2.60 mg/g CDW，乳酸积累从2.6 g/L降至0.3 g/L。产物对底物总产率从0.59 mg/g提高至最高1.15 mg/g（约2倍提升）。该策略通过简化碳源控制，显著缩短发酵周期、降低氧需求并减少副产物积累，为工业规模甲醇诱导重组蛋白生产提供了易行的工艺优化方案。
创新点
提出在诱导阶段批式添加山梨醇的简单策略，避免了双碳源流加带来的复杂控制和潜在抑制；消除了细胞适应甲醇的长时间滞后期，在24小时内实现高细胞密度（70 g CDW/L）；同时降低氧摄取率约2倍、减少特异性蛋白酶产生约1.2倍、消除乳酸积累峰，并提高产物对底物的总产率。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris (Mut+ E17) | 甲醇利用途径 | AOX1 | 醇氧化酶 | 催化 | 将甲醇氧化为甲醛的关键酶，受AOX1启动子调控，其活性与重组蛋白表达直接相关。 |
| Pichia pastoris (Mut+ E17) | AOX1基因表达调控 | AOX1启动子 | — | 调控 | 严格受甲醇诱导，甘油抑制，山梨醇不抑制，用于驱动重组蛋白表达。 |
| Pichia pastoris (Mut+ E17) | 重组蛋白表达 | EPO cDNA | 重组人促红细胞生成素(rHuEPO) | 调控 | 目的蛋白，作为细胞因子参与红细胞生成调控；在本研究中作为报告蛋白评估表达策略。 |
关键发现
- 添加山梨醇后，rHuEPO产量在24小时达到130 mg/L，而仅用甲醇时为80 mg/L
- 在t=18 h时，MS-0.03和MS-0.04条件的rHuEPO浓度分别比M-0.03高1.7倍和1.8倍。细胞浓度在t=24 h时达到70 g CDW/L（MS-0.03和MS-0.04），而M-0.03在54 h才达到80 g CDW/L。MS-0.03条件的特异性蛋白酶浓度为2.60 mg/g CDW，低于M-0.03的3.06 mg/g CDW。乳酸浓度从无山梨醇时的2.6 g/L降至有山梨醇时的0.3 g/L。最大氧摄取率（OUR）在有山梨醇时降低约2倍。产物对底物总产率Y_P/S'：M-0.03为0.59 mg/g，MS-0.03为0.85 mg/g（提高1.4倍），MS-0.02达1.15 mg/g（提高约2倍）。最高比rHuEPO生成速率在MS-0.04条件t=6 h时达0.172 mg/g/h，高于M-0.03的0.113 mg/g/h。山梨醇和甲醇被同时利用，山梨醇消耗速率不受甲醇流加速率影响。
研究结论
批式添加山梨醇作为共底物可显著提升Pichia pastoris (Mut+)菌株在甲醇诱导阶段的重组蛋白生产效率，缩短发酵时间、降低氧需求、减少蛋白酶和副产物，同时提高产率系数；该策略简单易行，适用于以甲醇为诱导剂的P. pastoris重组蛋白工业过程。