Improving the performance of industrial ethanol-producing yeast by expressing the aspartyl protease on the cell surface
- 作者
- Zhong-peng Guo, Liang Zhang, Zhong-yang Ding, Zheng-Xiang Wang, Gui-Yang Shi
- 单位
- The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Center for Bioresources and Bioenergy, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, People's Republic of China
- 杂志
- Yeast（2010）
- DOI
- 10.1002/yea.1811
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
工业乙醇发酵中，酵母无法利用原料中的可溶性蛋白，导致可同化氮源缺乏，发酵停滞、残糖高、乙醇产量低，而传统外加蛋白酶或氮源补充成本高且工艺复杂。
研究策略
在工业乙醇生产菌株Saccharomyces cerevisiae CICIMY0086中，通过分泌表达或细胞表面展示其自身的液泡天冬氨酸蛋白酶（PEP4基因编码），在发酵过程中原位降解大麦醪中的蛋白质，提供更多游离氨基氮（FAN），从而改善酵母生长和乙醇发酵性能。
研究路线图
核心内容
该研究针对工业乙醇发酵中可溶性蛋白无法被酵母利用而导致的氮源缺乏问题，在工业菌株酿酒酵母CICIMY0086中表达了自身来源的天冬氨酸蛋白酶PEP4，分别采取分泌表达（APA）和经α-凝集素锚定域的细胞表面展示（APB）两种策略，以在发酵中原位降解大麦醪蛋白、释放游离氨基氮。结果显示，重组菌的生长与发酵性能全面优于野生型，其中APB的乙醇得率达0.504 g/g葡萄糖，约为理论值的99%，残糖从野生型的34.13 g/L降至2.36 g/L，最大比生长速率由0.37/h提升至0.52/h，细胞蛋白含量升至57.82 g/100g生物量，甘油和丙酮酸等副产物也显著减少。细胞表面展示形式可避免游离蛋白酶对淀粉酶的破坏，更适用于同步糖化发酵，该策略在不引入异源基因的前提下同时提高了乙醇和单细胞蛋白产量。
创新点
首次在工业乙醇酵母细胞表面展示天冬氨酸蛋白酶；利用酵母自身基因PEP4和α-凝集素锚定域，未引入异源基因，具备GRAS安全性；同时提高了乙醇产量和单细胞蛋白（SCP）含量；细胞表面展示避免了分泌型蛋白酶对淀粉酶的降解，更适合同步糖化发酵（SSF）。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CICIMY0086 (工业乙醇生产菌株) | 蛋白质降解与氮源同化 | PEP4 | 天冬氨酸蛋白酶 (aspartyl protease) | 催化 | 重组菌APA为分泌表达，APB为细胞表面展示，可降解大麦醪中蛋白质释放氨基酸 |
| Saccharomyces cerevisiae CICIMY0086 (工业乙醇生产菌株) | 细胞壁蛋白锚定 | AGα1 (AG1) | α-凝集素C端锚定域 (α-agglutinin anchor) | 区室化 | 将PEP4编码的天冬氨酸蛋白酶锚定于酵母细胞壁表面 |
关键发现
- 在饲料大麦醪发酵中，重组菌APA（分泌表达）和APB（细胞表面展示）的生长和发酵性能显著优于野生型。野生型菌株的生物量得率为0.514±0.10 g biomass/g glucose，APA和APB分别为0.578±0.12和0.582±0.08 g biomass/g glucose；乙醇得率分别达到0.502±0.04和0.504±0.06 g ethanol/g glucose，约为理论最大值的98-99%，而野生型仅0.473±0.05；发酵结束时野生型残糖高达34.13±1.56 g/l，APA和APB分别仅为4.07±0.12和2.36±0.11 g/l。重组菌最大比生长速率（APA
- 51±0.09/h、APB
- 52±0.07/h）高于野生型（0.37±0.08/h），细胞数亦更高（野生型5.2×10^8/ml，APA
- 0×10^8/ml，APB
- 2×10^8/ml）。此外，重组菌的细胞蛋白含量（APA
- 25±1.8、APB
- 82±2.1 g/100g biomass）高于野生型（52.13±1.6），而副产物甘油和丙酮酸得率降低（甘油：野生型17.83±1.23，APA
- 46±1.12，APB
- 46±2.10 mg/g glucose；丙酮酸：野生型0.752±0.05，APA
- 456±0.06，APB
- 398±0.05 mg/g glucose）。重组菌在整个发酵中活力（AP值）保持在2.5以上，而野生型在68h降至1.8以下。分泌型APA的蛋白酶活性在培养基中达56.8 U/ml；细胞表面展示的APB细胞壁酶活为13.34±0.12 U/g。
研究结论
在工业乙醇酵母中表达天冬氨酸蛋白酶（分泌或表面展示）能够通过降解原料蛋白质提供更多可同化氮源，显著提高细胞生长、活力和乙醇得率，降低残糖和副产物；其中细胞表面展示形式避免了蛋白酶对淀粉酶的破坏，在实际同步糖化发酵（SSF）中更具应用价值，为燃料乙醇和单细胞蛋白生产提供了可行策略。