高级醇 · 代谢工程文献库

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Effect of dimorphic regulation on heterologous glucose oxidase production by Mucor circinelloides

作者
Astrid Bredenkamp, Harshad Velankar, Willem H. van Zyl, Johann F. Gorgens
单位
Department of Process Engineering, University of Stellenbosch; Department of Microbiology, University of Stellenbosch
杂志
Yeast（2010）
DOI
10.1002/yea.1793
所属领域
代谢工程
关键词
Mucor circinelloidesdimorphic fungiglucose oxidase
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解决的核心问题

研究二态性调控对重组Mucor circinelloides生产异源葡萄糖氧化酶的影响，并评估其作为异源蛋白生产宿主的潜力，以解决丝状真菌菌丝形态带来的发酵工程问题。

研究策略

在形态控制的生物反应器中，先以厌氧条件维持酵母样形态生长以获得生物量，再切换至好氧条件诱导菌丝生长并生产酶；比较重组菌株KFA199与其亲本ATCC 1216b及野生型CBS 232.29在不同气体氛围和补充物下的生长、葡萄糖氧化酶（GOX）和淀粉酶产量。

研究路线图

100%
研究问题：二态性调控对重组Mucor生产GOX的影响
策略：形态控制生物反应器（厌氧→好氧两阶段培养）
关键改造1：厌氧酵母样生长（Vogel's+麦角固醇/Tween-80，氮气）
关键改造2：好氧诱导菌丝生长与GOX生产
主要结果：GOX胞内0.56U/ml，胞外仅0.14U/ml；淀粉酶低于对照
结论：二态性未改善异源蛋白生产，但适合接合菌特异性酶
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核心内容

本研究利用二态真菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）的形态转换特性，探索其在异源蛋白生产中的应用潜力。通过在形态控制生物反应器中先以厌氧条件维持酵母样形态积累生物量，再切换好氧条件诱导菌丝生长并启动产酶，系统比较了重组菌株KFA199与其亲本及野生型在不同气体氛围和营养补充下的生长与产酶表现。结果显示，以乳糖替代葡萄糖可显著提升胞外葡萄糖氧化酶产量，20 g/L乳糖时达到0.9 U/mL culture，远高于葡萄糖条件下的0.34 U/mL。厌氧阶段最佳酵母样生长条件为Vogel's培养基添加麦角固醇与Tween-80并通入氮气，最高厌氧生长速率为0.14/h。然而好氧切换后重组菌的葡萄糖氧化酶主要积累于胞内（最高0.56 U/mL），胞外仅0.14 U/mL，分泌效率不佳；其淀粉酶产量（0.07 U/mL）也显著低于亲本（0.63 U/mL）和野生型（0.33 U/mL）。尽管二态性调控实现了阶段化形态控制，但异源蛋白产量整体低于其他真菌表达系统，提示该策略的优势未能转化为生产效益，该菌株可能更适用于接合菌特异性酶如脂肪酶的生产。

创新点

利用二态真菌Mucor circinelloides的形态转换进行异源蛋白生产；系统比较了氮气、氮气/二氧化碳混合气及补充麦角固醇/Tween-80对酵母样形态维持的效果；揭示了重组菌株GOX分泌差且主要在胞内积累。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Mucor circinelloides KFA199 葡萄糖氧化 gox 葡萄糖氧化酶 催化 来自黑曲霉的gox基因，由gpd1启动子驱动，在重组菌株中表达，好氧阶段胞内积累至0.56 U/ml。
Mucor circinelloides KFA199 糖酵解/基因表达调控 gpd1 甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子 调控 全长741 bp的gpd1启动子用于驱动gox基因表达，具有葡萄糖诱导特性。
Mucor circinelloides ATCC 1216b 淀粉降解 — 淀粉酶 催化 亲本菌株天然产生淀粉酶，在好氧生长于淀粉时分泌，最高胞外活性0.63 U/mlculture。
Mucor circinelloides CBS 232.29 淀粉降解 — 淀粉酶 催化 野生型菌株，在好氧生长于淀粉时产生淀粉酶，最高胞外活性0.33 U/mlculture。
Mucor circinelloides KFA199 淀粉降解 — 淀粉酶 催化 重组菌株自身淀粉酶产量较低，最高胞外活性0.07 U/mlculture，分泌量低于亲本和野生型。
Mucor circinelloides (KFA199, ATCC 1216b, CBS 232.29) 乙醇发酵 — — 能量供给 厌氧条件下在酵母样生长阶段产生乙醇，与生物量竞争碳源，导致生物量产率较低。

关键发现

  1. 摇瓶培养中Vogel's培养基获得最高胞外GOX浓度0.34±0.02 U/mlculture，用10 g/l和20 g/l乳糖替代葡萄糖时GOX分别增至0.44和0.9 U/mlculture
  2. 厌氧酵母样生长最适条件为Vogel's培养基补充麦角固醇/Tween-80并通氮气，重组菌KFA199最高厌氧生长速率0.14±0.02/h，生物量2.75-2.96 g/l
  3. 好氧切换后重组菌胞内GOX最大0.56 U/mlculture，胞外仅0.14 U/mlculture
  4. 淀粉酶产量KFA199为0.07 U/mlculture，亲本ATCC 1216b为0.63 U/mlculture，野生型CBS 232.29为0.33 U/mlculture
  5. 好氧培养重组菌最高菌丝浓度8.3±0.01 g/l（葡萄糖）和10.4 g/l（淀粉），亲本11.3 g/l，野生型9.1 g/l
  6. 厌氧阶段乙醇产量较高（KFA199乙醇产率0.42±0.02 g/g，最高0.48±0.19 g/g），好氧后乙醇被消耗。

研究结论

重组Mucor circinelloides在形态控制培养中生产的异源GOX和天然淀粉酶水平均低于其他真菌表达系统，二态性优势未能改善异源蛋白生产，但该菌株可能适合生产接合菌特异性酶（如脂肪酶）。