Heterologous carotenoid production in Saccharomyces cerevisiae induces the pleiotropic drug resistance stress response
- 作者
- René Verwaal, Yang Jiang, Jing Wang, Jean-Marc Daran, Gerhard Sandmann, Johan A. van den Berg, Albert J. J. van Ooyen
- 单位
- Fungal Genomics, Laboratory of Microbiology, Wageningen University; Department of Biotechnology, Delft University of Technology; Biosynthesis Group, Molecular Biosciences 213, J. W. Goethe Universität; Klyuver Centre for Genomics of Industrial Fermentation
- 杂志
- Yeast（2010）
- DOI
- 10.1002/yea.1807
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
异源类胡萝卜素生产对酿酒酵母生理和转录组的影响，尤其是高产类胡萝卜素诱导的多效药物耐药（PDR）应激反应的机制
研究策略
利用葡萄糖限制的恒化培养结合全基因组DNA微阵列分析，比较低产（Orange01）和高产（Orange02）类胡萝卜素菌株与参考菌株的转录组；通过qPCR验证关键基因表达；利用向日葵油检测类胡萝卜素分泌；通过基因敲除（pdr10等）验证转运蛋白功能
核心内容
该研究利用葡萄糖限制的恒化培养结合全基因组DNA微阵列，系统比较了低产（Orange01）和高产（Orange02）类胡萝卜素酿酒酵母菌株与参考菌株的转录组差异。Orange01总类胡萝卜素为211 μg/g干重（β-胡萝卜素占89%），Orange02则达1752 μg/g干重（八氢番茄红素占91%）。高产菌株中36个基因上调≥1.5倍，其中16个受Pdr1/Pdr3/Pdr8/Yrr1/Yrm1调控，包括ABC转运蛋白PDR5、PDR10、PDR15、SNQ2和主要协助转运蛋白TPO1、FLR1，表明高产类胡萝卜素特异性诱导多效药物耐药（PDR）应激反应。添加20%向日葵油后，Orange02培养液中检测到0.14 μg/mlβ-胡萝卜素，证明其可分泌至油相。敲除PDR10后，含类胡萝卜素基因质粒的转化效率从2000降至50个转化子/μg DNA，最大生长速率降低25%，总类胡萝卜素产量降低60%（从612降至247 μg/g dw），而敲除PDR5无显著影响。结果表明，类胡萝卜素积累引起的膜应激激活PDR反应，Pdr10在应对该应激和维持类胡萝卜素生产中起关键作用，是异源类胡萝卜素生产的潜在改造靶点。
创新点
首次在恒化培养条件下系统研究异源类胡萝卜素生产对酿酒酵母转录组的影响；发现高产类胡萝卜素特异性诱导PDR应激反应，包括ABC转运蛋白和主要协助转运蛋白；证明β-胡萝卜素可分泌到油相中；揭示Pdr10在类胡萝卜素生产中的重要作用
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtYB | CrtYB | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous的双功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶，催化GGPP生成八氢番茄红素及番茄红素环化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | CrtI | 催化 | 来自X. dendrorhous的八氢番茄红素脱饱和酶，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE | CrtE | 催化 | 来自X. dendrorhous的GGPP合酶，催化FPP转化为GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素生物合成途径 | BTS1 | Bts1 | 催化 | 酿酒酵母内源GGPP合酶，可替代CrtE提供GGPP前体 |
| Saccharomyces cerevisiae | 多效药物耐药（PDR）应激响应 | PDR5 | Pdr5 | 转运 | 质膜ABC转运蛋白，参与细胞解毒，在高产类胡萝卜素菌株中显著上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 多效药物耐药（PDR）应激响应 | PDR10 | Pdr10 | 转运 | 质膜ABC转运蛋白，调控膜微环境；敲除后类胡萝卜素产量和生长速率显著下降 |
| Saccharomyces cerevisiae | 多效药物耐药（PDR）应激响应 | PDR15 | Pdr15 | 转运 | 质膜ABC转运蛋白，一般应激响应因子，在高产菌株中上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 多效药物耐药（PDR）应激响应 | SNQ2 | Snq2 | 转运 | 质膜ABC转运蛋白，参与多种药物外排，在高产菌株中上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 多效药物耐药（PDR）应激响应 | TPO1 | Tpo1 | 转运 | 主要协助转运蛋白超家族成员，可能参与多胺类物质外排，在高产菌株中上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 多效药物耐药（PDR）应激响应 | FLR1 | Flr1 | 转运 | 主要协助转运蛋白超家族成员，参与多种药物耐受，在高产菌株中上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | PDR转录调控网络 | PDR1 | Pdr1 | 调控 | 转录因子，调控PDR基因表达，其靶基因包括PDR5、SNQ2等 |
| Saccharomyces cerevisiae | PDR转录调控网络 | PDR3 | Pdr3 | 调控 | 转录因子，结合PDRE元件，调控PDR5等耐药基因表达；PDR3本身也在高产菌株中上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | PDR转录调控网络 | PDR8 | Pdr8 | 调控 | 转录因子，参与PDR调控，与Pdr1/Pdr3有重叠靶基因 |
| Saccharomyces cerevisiae | PDR转录调控网络 | YRR1 | Yrr1 | 调控 | 转录因子，调控多效药物耐药相关基因 |
| Saccharomyces cerevisiae | PDR转录调控网络 | YRM1 | Yrm1 | 调控 | Yrr1的旁系同源转录因子，参与耐药调控 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtYB | CrtYB | 催化 | 天然类胡萝卜素产生菌中的双功能酶，用于构建酿酒酵母重组菌株 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | CrtI | 催化 | 天然类胡萝卜素产生菌中的脱饱和酶，用于构建酿酒酵母重组菌株 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE | CrtE | 催化 | 天然类胡萝卜素产生菌中的GGPP合酶，用于构建酿酒酵母重组菌株 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素分泌 | SPS100 | Sps100 | 调控 | 孢子壁蛋白，在高产菌株中表达下调，可能反映细胞壁结构变化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 铁离子稳态 | FET3 | Fet3 | 催化 | 铁氧化酶，在高产菌株中表达下调，属于细胞救援/防御相关基因 |
关键发现
- Orange01菌株在恒化培养中总类胡萝卜素为211 μg/g干重，其中β-胡萝卜素占89%
- Orange02菌株总类胡萝卜素为1752 μg/g干重，其中八氢番茄红素占91%
- 高产菌株Orange02中36个基因上调≥1.5倍，其中16个受Pdr1/Pdr3/Pdr8/Yrr1/Yrm1调控，包括ABC转运蛋白PDR5、PDR10、PDR15、SNQ2和主要协助转运蛋白TPO1、FLR1
- 添加20%向日葵油后，Orange02培养液中检测到0.14 ± 0.06 μg/ml β-胡萝卜素，而X. dendrorhous无分泌
- 敲除PDR10后，含类胡萝卜素基因质粒的转化效率从2000个转化子/μg DNA降至50个转化子/μg DNA，生长速率降低25%（μmax从0.35降至0.23 h⁻¹），总类胡萝卜素产量降低60%（从612±51降至247±52 μg/g dw）
- 敲除PDR5无显著影响
研究结论
在酿酒酵母中高产类胡萝卜素会导致膜应激，激活多效药物耐药（PDR）应激反应，ABC转运蛋白和主要协助转运蛋白可能介导类胡萝卜素向胞外分泌；Pdr10在应对类胡萝卜素诱导的膜应激中发挥关键作用，是异源类胡萝卜素生产的潜在改造靶点