Directed Evolution for Thermostabilization of a Hygromycin B Phosphotransferase from Streptomyces hygroscopicus
- 作者
- Naohisa Sugimoto, Yasuaki Takakura, Kentaro Shiraki, Shinya Honda, Naoki Takaya, Takayuki Hoshino, Akira Nakamura
- 单位
- Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba; Division of Applied Physics, Faculty of Pure and Applied Sciences, University of Tsukuba; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)
- 杂志
- Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry（2013）
- DOI
- 10.1271/bbb.130486
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何将中温性潮霉素B磷酸转移酶（HYG）热稳定化，使其能在嗜热菌Thermus thermophilus中作为筛选标记基因使用。
研究策略
利用Thermus thermophilus作为宿主，通过体内定向进化策略，逐步提高培养温度和抗生素浓度筛选热稳定的HYG突变体，并结合DNA shuffling和理性突变组合构建高稳定突变体。
核心内容
该研究针对中温性潮霉素B磷酸转移酶（HYG）热稳定性不足、无法在嗜热菌Thermus thermophilus中作为筛选标记的问题，以T. thermophilus HB27 TH104为宿主开展体内定向进化。通过逐步提高培养温度和潮霉素B浓度筛选耐热突变体，并结合DNA shuffling和理性突变组合，最终获得含7个氨基酸替换（L79F、G189R、S252P、L290M、E237K、D285N、E300D）及三氨基酸重复（LDR）的突变体HYG10。HYG10在T. thermophilus中提供的潮霉素抗性温度上限由60°C提升至74°C；酶学分析显示其半失活温度由35°C升至48°C，最适温度由47°C升至59°C，差示扫描量热法测定的熔解温度由40.4°C升至52.6°C，比活力由0.70 units/mg提高至1.04 units/mg。结构分析揭示表面突变引入的亲水残基及LDR重复通过反向疏水效应增强蛋白在水溶液中的稳定性。该工作为嗜热菌遗传操作提供了可在74°C下使用的筛选标记，也展示了体内定向进化在酶热稳定化改造中的有效性。
创新点
首次获得了HYG的七重氨基酸替换和三氨基酸重复突变体HYG10，热稳定性提高13°C；解析了突变对酶活性和结构的影响，提出反向疏水效应和疏水核心强化等稳定机制。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Thermus thermophilus HB27 TH104 | 潮霉素B抗性 | hyg | HYG | 催化 | 来自吸水链霉菌的潮霉素B磷酸转移酶，野生型在60°C下赋予HygB抗性，用于体内定向进化筛选。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 重组蛋白表达 | hyg10 | HYG10 | 催化 | HYG突变体，含7个氨基酸替换和3个氨基酸重复（LDR），热稳定性显著提高，最高抗性温度74°C。 |
关键发现
- 野生型hyg在T. thermophilus中提供HygB抗性最高60°C
- 定向进化获得突变体HYG10（含7个氨基酸替换L79F、G189R、S252P、L290M、E237K、D285N、E300D和三氨基酸重复LDR），其最高抗性温度达74°C。酶学分析显示HYG10的半失活温度（T_half）由35°C升至48°C，最适温度由47°C升至59°C
- CD测定的表观Tm由35.9°C升至53.0°C，DSC测定的Tm由40.4°C升至52.6°C
- ΔHm分别增加约1.8倍和2.2倍。比活力由0.70 units/mg升至1.04 units/mg
- 动力学参数显示Km(HygB)从16.7增至30.0 μM，kcat(HygB)从6.4增至8.0 s-1，Ki从0.61增至1.27 mM
- ATP的Km从42.3增至82.2 μM，kcat从2.5增至5.6 s-1
- 激活能Ea从54.7降至49.6 kJ/mol。突变位于表面的G189R、E237K等增加了亲水性，三氨基酸重复（LDR）位于表面，共同通过反向疏水效应提高在水溶液中的稳定性。
研究结论
通过体内定向进化获得了热稳定化的HYG10突变体，其作为筛选标记在T. thermophilus中最高耐受74°C，酶的热稳定性和最适温度显著提高，为嗜热菌基因操作提供了新的筛选标记。