Overproduction of Soluble Trichodiene Synthase from Fusarium sporotrichioides in Escherichia coli
- 作者
- David E. Cane, Zhen Wu, John S. Oliver, Thomas M. Hohn
- 单位
- Department of Chemistry, Box H, Brown University, Providence, Rhode Island 02912; Mycotoxin Research Unit, USDA/ARS, National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois 61604
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（1993）
- DOI
- 10.1006/abbi.1993.1056
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
真菌Trichodiene synthase在大肠杆菌中的表达量极低（仅占总蛋白的0.05-0.1%），难以获得足量酶蛋白用于深入的机制和结构研究。
研究策略
采用表达盒PCR（ECPCR）方法，将T7基因10核糖体结合位点和翻译间隔序列置于trichodiene synthase编码基因上游，克隆到含T7启动子和rmBT1T2转录终止子的pLM1载体中，转化E. coli BL21(DE3)后经IPTG诱导实现高水平可溶性表达。
核心内容
本研究针对真菌trichodiene synthase在大肠杆菌中表达量极低（仅占总蛋白0.05–0.1%）的问题，采用表达盒PCR策略，将T7基因10的核糖体结合位点及翻译间隔序列置于该酶编码基因上游，克隆至含T7启动子和rmBT1T2转录终止子的pLM1载体，并转化E. coli BL21(DE3)后以IPTG诱导表达。结果显示重组酶表达量达可溶蛋白的20–30%，较原系统提升数百倍；从500 ml培养物中纯化获得6 mg电泳纯酶，比活性为169 units/mg，Km为83±4 nM，与天然酶（75±4 nM）基本一致；重组酶N端序列为MENFP，表观分子量46.3 kDa，且在BL21(DE3)中的活性约为JM109(DE3)的10倍。该工作通过优化翻译起始信号和宿主背景，首次实现该倍半萜合成酶在大肠杆菌中的高可溶表达，所得重组酶在动力学与电泳行为上与天然酶高度一致，为后续活性位点鉴定及蛋白质结构解析提供了充足且可靠的酶源。
创新点
['首次实现了trichodiene synthase在大肠杆菌中占可溶蛋白20-30%的高水平表达（原系统仅为0.05-0.1%）', '构建了稳定的表达质粒pZW03，并采用两步纯化法获得电泳纯重组酶', '重组酶与天然酶在稳态动力学参数和SDS-PAGE迁移率上一致，N端序列仅多一个起始甲硫氨酸']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 (FPP → trichodiene) | Tox5 | Trichodiene synthase | 催化 | 来自Fusarium sporotrichioides，催化法尼基焦磷酸(FPP)环化为trichodiene；重组蛋白占可溶蛋白20-30% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | T7 gene 10 | — | 调控 | pLM1载体上的T7启动子和翻译前导序列，以及PCR引入的T7 gene 10核糖体结合位点和翻译间隔序列，驱动Tox5基因高水平转录/翻译 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | rmBT1T2 | — | 调控 | pLM1载体上的大肠杆菌rmB操纵子T1T2双转录终止子，增强转录终止和mRNA稳定性 |
| Escherichia coli JM109(DE3) | — | Tox5 | Trichodiene synthase | 催化 | 与BL21(DE3)对比，活性约为其1/10，因BL21(DE3)缺失lon蛋白酶，重组蛋白稳定性更高 |
关键发现
- 重组trichodiene synthase表达量达可溶蛋白的20-30%（占总细胞蛋白30%）
- 从500 ml培养物纯化得到6 mg纯酶，纯化后比活性为169 units/mg，Km为83±4 nM（天然酶为75±4 nM）
- 重组酶N端序列为MENFP，SDS-PAGE表观分子量为46.3 kDa
- 在BL21(DE3)中的活性比JM109(DE3)高约10倍
- 纯化过程中Q Sepharose阴离子交换层析后比活为164 units/mg，Superose 12凝胶过滤后为169 units/mg
- 总回收率12%。
研究结论
利用T7表达系统成功实现了trichodiene synthase在大肠杆菌中的高可溶表达，重组酶在动力学和电泳行为上与天然酶基本一致，为后续活性位点鉴定和蛋白结构研究提供了充足的酶源。