Cloning, Expression, and Characterization of epi-Cedrol Synthase, a Sesquiterpene Cyclase from Artemisia annua L
- 作者
- Per Mercke, John Crock, Rodney Croteau, Peter E. Brodelius
- 单位
- Department of Plant Biochemistry, Lund University; Institute of Biological Chemistry, Washington State University; Department of Natural Sciences, University of Kalmar
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（1999）
- DOI
- 10.1006/abbi.1999.1358
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表征黄花蒿（Artemisia annua）中的一种倍半萜环化酶（epi-cedrol synthase），以研究青蒿素生物合成途径并潜在用于代谢工程提高青蒿素产量。
研究策略
从黄花蒿叶片cDNA文库中，以烟草epi-aristolochone synthase cDNA为探针筛选获得全长epi-cedrol synthase cDNA，在大肠杆菌中异源表达并部分纯化，通过GC-MS和酶动力学分析表征重组酶的产物特异性和催化性质。
核心内容
该研究从黄花蒿叶片cDNA文库中筛选并克隆了编码epi-cedrol合酶的全长cDNA（1951 bp，开放阅读框1641 bp，编码547个氨基酸，约63.5 kDa），并在大肠杆菌中异源表达和部分纯化该重组酶，通过GC-MS与酶动力学分析表征其催化功能。结果显示，该酶以法尼基焦磷酸（FDP）为底物时，主要生成含氧倍半萜（占97%），其中epi-cedrol占96%、cedrol占4%；烯烃产物中α-cedrene占57%、β-cedrene占13%等。酶动力学测定表明，FDP的Km在pH 7.0和9.0下分别为0.4 μM和1.3 μM，Mg²⁺的Km为80 μM，最适pH为8.5–9.0。此外，该酶还能利用香叶基焦磷酸（GDP）生成单萜，活性为FDP的15%，主要产物为柠檬烯（45%）和萜品油烯（42%）。该研究首次克隆了催化生成倍半萜醇epi-cedrol的合酶基因，证实其为一种多功能倍半萜环化酶，为深入理解倍半萜合酶的结构与功能关系以及青蒿素生物合成途径的调控提供了重要基础。
创新点
首次克隆了编码催化生成倍半萜醇（epi-cedrol）的倍半萜合酶cDNA；该酶以FDP为底物主要生成含氧倍半萜（97%），并能利用GDP生成单萜。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli XL1-Blue | 倍半萜生物合成 | epi-cedrol synthase cDNA (pAC12) | epi-cedrol synthase | 催化 | 重组表达，催化FDP生成epi-cedrol等倍半萜产物 |
| Artemisia annua L. | 倍半萜生物合成 | epi-cedrol synthase (内源) | epi-cedrol synthase | 催化 | 从叶片cDNA文库克隆得到，在植物中天然表达 |
关键发现
- 克隆获得全长cDNA长1951 bp，ORF 1641 bp编码547个氨基酸（63.5 kDa）
- 重组酶催化FDP生成3%烯烃和97%含氧倍半萜，其中epi-cedrol占96%、cedrol占4%
- 烯烃中α-cedrene 57%、β-cedrene 13%、(E)-β-farnesene 5%、α-acoradiene 1%、(E)-α-bisabolene 8%、未知烯烃16%
- 对FDP的Km在pH7.0为0.4 μM、pH9.0为1.3 μM，Mg2+的Km为80 μM（pH7.0和9.0均如此）
- 对GDP的活性为FDP的15%，单萜产物中柠檬烯45%、萜品油烯42%、γ-萜品烯8%、月桂烯5%、α-萜品烯2%
- 最适pH为8.5-9.0。
研究结论
成功克隆并表征了来自黄花蒿的epi-cedrol synthase，该酶是一种多功能倍半萜环化酶，主要催化FDP环化生成epi-cedrol，为研究倍半萜合成酶结构与功能提供了新视角。