The Molecular Cloning of 8-Epicedrol Synthase from Artemisia annua
- 作者
- Ling Hua, Seiichi P. T. Matsuda
- 单位
- Department of Chemistry and Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University, Houston, Texas 77005
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（1999）
- DOI
- 10.1006/abbi.1999.1357
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从青蒿（Artemisia annua）中克隆倍半萜合酶基因，以寻找参与青蒿素生物合成的关键酶。
研究策略
基于已知双子叶植物倍半萜合酶（如天仙子vetispiradiene合酶、烟草epiaristolochene合酶、棉花cadinene合酶）的保守序列设计简并PCR引物，从青蒿cDNA文库中扩增同源片段，并以此片段为探针筛选cDNA文库获得全长基因；在大肠杆菌中异源表达重组蛋白，并鉴定其催化产物。
研究路线图
核心内容
该研究以青蒿为材料，基于已知双子叶植物倍半萜合酶的保守序列设计简并引物，通过PCR扩增和cDNA文库筛选，首次克隆了编码8-epicedrol合酶的全长基因。该基因开放阅读框长1641 bp，编码约64 kDa的蛋白，与双子叶倍半萜合酶有35%—38%的氨基酸一致性。重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中异源表达后，能将法尼基焦磷酸环化为96:4的(-)-8-epicedrol和cedrol混合物，经硅胶色谱纯化获得7.0 mg产物（21%收率），鉴定为C15H26O倍半萜醇。青蒿提取物中未检测到该产物，推测8-epicedrol在植物体内被快速代谢，且其不太可能是青蒿素的前体。该工作证明了同源克隆方法可发现新的倍半萜合酶及微量天然产物，也为后续寻找青蒿素生物合成关键酶4,11-amorphadiene合酶提供了方法基础。
创新点
首次克隆了编码环状倍半萜醇合酶的基因（8-epicedrol synthase）；鉴定了一种未被报道过的新天然产物8-epicedrol；证明同源克隆方法可用于发现植物中因快速代谢而难以检测的微量天然产物。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua (青蒿) | 倍半萜生物合成 | 8-epicedrol synthase gene | 8-epicedrol synthase | 催化 | 从青蒿cDNA文库中克隆，催化FDP环化为8-epicedrol（96%）和cedrol（4%）的混合物。 |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 异源表达 | 8-epicedrol synthase gene (重组) | 8-epicedrol synthase (重组His标签蛋白) | 催化 | 用于异源表达和功能表征，重组蛋白带有N端六组氨酸标签。 |
关键发现
- 从青蒿cDNA文库（约10^6独立转化子，平均插入片段约1.3 kb）中克隆到1641 bp的开放阅读框，编码约64 kDa蛋白，与双子叶倍半萜合酶具有35-38%氨基酸一致性
- 重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达后，将法尼基焦磷酸（FDP）环化为96:4的(-)-8-epicedrol和cedrol混合物（GC保留时间9.84和9.96 min，面积比4:96）
- 硅胶色谱获得7.0 mg产物混合物（21%收率），鉴定为C15H26O倍半萜醇（Mr 222）
- 青蒿提取物中未检测到cedrol差向异构体。
研究结论
成功克隆了青蒿8-epicedrol合酶基因，证明同源克隆方法可发现新的倍半萜合酶和天然产物；该酶催化FDP环化生成8-epicedrol（伴随少量cedrol），但8-epicedrol可能在植物体内被快速代谢，且不太可能是青蒿素的前体；该工作为寻找4,11-amorphadiene合酶基因提供了方法基础。