Isoprenoid Biosynthesis via a Mevalonate-Independent Pathway in Plants: Cloning and Heterologous Expression of 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate Reductoisomerase from Peppermint
- 作者
- B. Markus Lange, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, and Department of Biochemistry and Biophysics, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6340
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（1999）
- DOI
- 10.1006/abbi.1999.1168
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物中异戊烯基焦磷酸生物合成存在不依赖甲羟戊酸的全新途径，该途径中第二步关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）在植物中的基因尚未被克隆。
研究策略
利用DXR基因保守区域设计PCR引物，以薄荷油腺细胞cDNA文库为模板扩增同源片段，进而筛选全长cDNA；再通过大肠杆菌异源表达和酶活检测验证该cDNA编码的功能酶。
核心内容
该研究首次从高等植物薄荷中克隆了1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）的cDNA，并验证了其功能。研究者利用DXR保守区设计引物，从薄荷油腺cDNA文库中筛选出全长克隆，开放阅读框长1425 bp，编码475个氨基酸，其中N端前73个氨基酸为质体靶向序列，去除后成熟酶约43.5 kDa，与细菌DXR明显不同。序列分析显示薄荷与拟南芥推定DXR的一致性达84.2%，与大肠杆菌的一致性为43.0%。将去除转运肽的成熟酶在大肠杆菌中异源表达，重组蛋白在NADPH和Mn2+存在下可将底物转化为新产物，经酸水解衍生化后与标准品2-C-甲基-D,L-赤藓醇的GC-MS保留时间（7.1±0.1分钟）和质谱图一致，确认催化产物为2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸，而空载体对照无活性。该工作证实植物质体中存在与细菌同源的不依赖甲羟戊酸途径第二步反应，DXR作为该途径的关键限速酶，可作为新型除草剂和抗生素的潜在靶点。
创新点
首次从高等植物（薄荷）中克隆DXR cDNA，并证实其编码蛋白带有N端质体转运肽，与微生物DXR不同；通过大肠杆菌功能表达并确认催化产物为2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP（丙酮酸/甘油醛-3-磷酸）途径 | pMPDXR18 (Mentha × piperita DXR) | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR） | 催化 | 薄荷cDNA全长克隆，在大肠杆菌中异源表达，催化DXP转化为MEP，带有质体转运肽前体形式仍有活性。 |
| Escherichia coli | MEP（丙酮酸/甘油醛-3-磷酸）途径 | pECDXR20 (E. coli DXR) | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR） | 催化 | 作为阳性对照，验证酶活反应产物。 |
| Mentha × piperita | MEP（丙酮酸/甘油醛-3-磷酸）途径 | DXR (pMPDXR1/18) | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶前体 | 催化 | 从薄荷油腺细胞cDNA文库中克隆，含N端质体转运肽（73 aa），成熟酶约43.5 kDa，定位于质体。 |
| Arabidopsis thaliana | MEP（丙酮酸/甘油醛-3-磷酸）途径 | 推定DXR基因 | 推定1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 从花蕾cDNA文库中获得20个阳性克隆，均5'端截短，与薄荷DXR有84.2%一致性。 |
关键发现
- 薄荷DXR cDNA开放阅读框长1425 bp，编码475个氨基酸，前73个氨基酸为质体靶向序列，去除后成熟酶约43.5 kDa
- 薄荷与拟南芥推定DXR序列一致性84.2%，与大肠杆菌一致性43.0%。异源表达实验显示，重组薄荷DXR在NADPH和Mn2+存在下可将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化为新产物，其保留时间为34.0分钟（底物55.7分钟），酸水解衍生化后与标准品2-C-甲基-D,L-赤藓醇的GC-MS保留时间（7.1±0.1分钟）和质谱图一致
- 未含插入片段的对照无活性。筛选薄荷油腺cDNA文库2.5×10^4个噬菌斑获得5个全长克隆，拟南芥花蕾文库2×10^5个噬菌斑获得20个阳性克隆。
研究结论
该研究证明薄荷中存在与细菌同源的DXR酶，其N端质体转运肽引导酶进入质体，执行不依赖甲羟戊酸途径的第二步反应；该酶是植物质体异戊二烯生物合成的关键限速步骤，可作为新型除草剂和抗生素的靶点。