Molecular Cloning, Expression, and Characterization of Amorpha-4,11-diene Synthase, a Key Enzyme of Artemisinin Biosynthesis in Artemisia annua L.
- 作者
- Per Mercke, Marie Bengtsson, Harro J. Bouwmeester, Maarten A. Posthumus, Peter E. Brodelius
- 单位
- Department of Plant Biochemistry, Lund University; Department of Plant Protection Sciences, Swedish University of Agricultural Sciences; Plant Research International Business Unit Cell Cybernetics; Department of Biomolecular Sciences, Laboratory of Organic Chemistry, Wageningen University and Research Centre; Department of Chemistry and Biomedical Sciences, University of Kalmar
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2000）
- DOI
- 10.1006/abbi.2000.1962
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
克隆并表征青蒿素生物合成关键酶紫穗槐二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase），为通过基因工程提高青蒿素产量提供靶点，因为该酶催化的环化步骤被视为青蒿素合成的限速步骤。
研究策略
从青蒿（Artemisia annua）叶片cDNA文库中利用同源探针筛选获得紫穗槐二烯合酶cDNA克隆（NAC），在大肠杆菌中表达重组酶，通过GC-MS鉴定产物结构，测定酶学参数（pH、Km），并依据副产物组成和已知晶体结构推测催化机理。
研究路线图
核心内容
该研究从青蒿叶片cDNA文库中克隆了紫穗槐二烯合酶基因，并在大肠杆菌中实现了异源表达。所获cDNA全长2080 bp，编码546个氨基酸，预测分子量63.9 kDa。重组酶催化法尼基二磷酸环化，产物中烯烃占97.5%，其中主产物amorpha-4,11-diene占91.2%，另含少量β-法尼烯、γ-蛇麻烯及两种含氧倍半萜等副产物；以香叶基二磷酸为底物未检测到单萜合酶活性。酶的最适pH范围为7.5至9.0，对法尼基二磷酸、镁离子和锰离子的Km值分别为0.9、70和13 μM，其中法尼基二磷酸的Km与天然纯化酶（0.6 μM）接近。依据副产物中检出的α-红没药醇和β-倍半水芹烯，并结合无germacrene类产物的事实，提出了该酶催化法尼基二磷酸先经1,6-环化生成红没药基阳离子、再经1,10-环化生成amorphyl阳离子并去质子化生成主产物的新机制。这一工作为通过基因工程上调该限速酶以提高青蒿素产量提供了分子靶点。
创新点
首次从青蒿中克隆并异源表达紫穗槐二烯合酶；通过GC-MS详细解析了重组酶产生的9种倍半萜产物（主产物amorpha-4,11-diene占91.2%）；提出该酶催化FDP环化经历先1,6-环化再1,10-环化的新机制；确认该酶无单萜合酶活性。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) pLysS | 青蒿素生物合成途径 | ADS (NAC cDNA) | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 重组菌株用于异源表达ADS，催化FDP环化生成以amorpha-4,11-diene为主的倍半萜产物 |
| Artemisia annua L. | 青蒿素生物合成途径 | ADS (内源基因) | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 植物叶片提取物中该酶为主要倍半萜合酶，其主产物与重组酶一致 |
| — | 青蒿素生物合成途径 | — | Epi-cedrol synthase (作为同源比较对象) | 催化 | 与ADS同源于青蒿，氨基酸序列相似，用于序列比对和机理对比 |
关键发现
- 获得的cDNA全长2080 bp，含1641 bp开放阅读框，编码546个氨基酸（预测分子量63.9 kDa，等电点5.47），推导氨基酸序列与其他被子植物倍半萜合酶有34.8%-51.8%的同一性。重组酶在E. coli中表达后催化FDP生成97.5%烯烃和2.5%含氧倍半萜
- 其中主要烯烃为amorpha-4,11-diene（91.2%），其他烯烃包括(E)-β-farnesene（0.8%）、amorpha-4,7(11)-diene（3.7%）、γ-humulene（1.0%）、β-sesquiphellandrene（0.5%）和未知烯烃（0.2%）
- 含氧产物为amorpha-4-en-11-ol（0.2%，暂定）、amorpha-4-en-7-ol（2.1%）和α-bisabolol（0.3%，暂定）。以GDP为底物未检测到单萜合酶活性。重组酶pH最适范围为7.5-9.0
- 在pH 7.5下，对FDP、Mg2+、Mn2+的Km值分别为0.9、70和13 μM，其中FDP的Km与天然纯化酶的0.6 μM相近。产物中检出的α-bisabolol和β-sesquiphellandrene证明存在初始1,6-环化
- 结合不存在germacrene类产物，提出反应先发生1,6-环化生成bisabolyl阳离子，进而1,10-环化形成amorphyl阳离子，再经去质子化生成amorpha-4,11-diene。
研究结论
成功克隆并表达了青蒿中的紫穗槐二烯合酶，重组酶具有与天然酶相似的催化特性和动力学参数，是青蒿素生物合成途径中的关键环化酶。该酶的副产物分布支持初始1,6-环化随后1,10-环化的反应机理，为后续利用基因工程上调该酶以提高青蒿素产量奠定了分子基础。