Amorpha-4,11-diene Synthase of Artemisia annua: cDNA Isolation and Bacterial Expression of a Terpene Synthase Involved in Artemisinin Biosynthesis
- 作者
- Yung- Jin Chang, Seung- Hwan Song, Si- Hyung Park, Soo- Un Kim
- 单位
- School of Agricultural Biotechnology and the Research Center for New Biomaterials in Agriculture, Seoul National University, Suwon 441-744, Korea
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2000）
- DOI
- 10.1006/abbi.2000.2061
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定青蒿素生物合成关键酶amorpha-4,11-diene synthase的基因，揭示其催化功能，为通过代谢工程提高青蒿素产量奠定基础。
研究策略
利用倍半萜合成酶保守区设计引物，PCR扩增基因组DNA获得片段，经Northern和Southern分析验证，再通过RACE获得全长cDNA，构建大肠杆菌表达载体，检测酶活性和产物。
核心内容
本研究从青蒿中克隆并功能鉴定了青蒿素生物合成的关键酶——amorpha-4,11-diene synthase。利用倍半萜合成酶保守区设计引物，经PCR扩增基因组DNA并结合RACE技术获得全长cDNA，其长度为2106 bp，开放阅读框1641 bp，编码546个氨基酸。推导的蛋白序列与棉花(+)-δ-cadinene synthase同源性为41%，与烟草5-epi-aristolochene synthase同源性为36%。将目的基因构建至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中异源表达，获得63.5 kDa的可溶蛋白。酶活测定显示该酶比活力为0.212 nmol·h⁻¹·mg protein⁻¹，GC-MS分析确认其催化法尼基焦磷酸环化生成amorpha-4,11-diene。Southern blot表明该基因为单拷贝。该工作首次实现了青蒿amorpha-4,11-diene synthase的克隆与细菌功能表达，为解析青蒿素生物合成途径及利用代谢工程提高青蒿素产量提供了关键的基因元件和催化机制基础。
创新点
首次克隆了青蒿amorpha-4,11-diene synthase全长cDNA；在大肠杆菌中功能表达并确证催化产物；提出了环化反应机制。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 青蒿素生物合成（倍半萜生物合成） | kcs12 | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化法尼基二磷酸(FDP)环化生成amorpha-4,11-diene |
关键发现
- 克隆到2106 bp全长cDNA，含1641 bp开放阅读框，编码546个氨基酸
- 推导蛋白与烟草5-epi-aristolochene synthase有36%同一性，与棉花(+)-δ-cadinene synthase有41%同一性
- 大肠杆菌表达产生63.5 kDa蛋白
- 酶比活力为0.212 nmol·h^-1·mg protein^-1
- GC-MS鉴定产物为amorpha-4,11-diene（保留时间9.3 min，m/z 204）
- Southern显示单拷贝基因。
研究结论
成功克隆和表达青蒿amorpha-4,11-diene synthase，证明其催化FDP环化生成amorpha-4,11-diene，为青蒿素生物合成途径解析和代谢工程改造提供了关键元件。