高级醇 · 代谢工程文献库

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Demonstration That Menthofuran Synthase of Mint (Mentha) Is a Cytochrome P450 Monooxygenase: Cloning, Functional Expression, and Characterization of the Responsible Gene

作者
Cinzia M. Bertea, Michel Schalk, Frank Karp, Massimo Maffei, Rodney Croteau
单位
Department of Plant Biology, University of Turin; Institute of Biological Chemistry, Washington State University
杂志
Archives of Biochemistry and Biophysics（2001）
DOI
10.1006/abbi.2001.2378
所属领域
代谢工程
关键词
(+)-menthofuran(+)-pulegoneMentha × piperitaMentha × pulegiumcytochrome P450 monooxygenasementhofuran synthasemonoterpene biosynthesispulegone hydroxylase
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解决的核心问题

确定薄荷中(+)-薄荷呋喃合酶是一种细胞色素P450单加氧酶，并克隆、功能表达和表征该基因，以改善薄荷精油品质。

研究策略

从薄荷油腺细胞cDNA文库中分离P450候选克隆，分别在酿酒酵母和大肠杆菌中异源功能表达，并通过体内/体外酶活测定验证其催化(+)-胡薄荷酮转化为(+)-薄荷呋喃的功能。

研究路线图

100%
核心问题：薄荷呋喃合酶是否为细胞色素P450？
策略：油腺cDNA文库筛选P450候选克隆
策略：酵母与大肠杆菌异源功能表达
关键改造：基因克隆与N端修饰
结果：体内外酶活验证催化功能
关键结果：序列分析与P450特性鉴定
结果：薄荷呋喃含量与微体P450定量
结果：表达体系产物产量对比分析
结论：mw326编码P450单加氧酶，可改良薄荷品质
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核心内容

该研究从薄荷油腺细胞cDNA文库中分离到一个编码细胞色素P450单加氧酶的候选基因mw326，并将其分别在酿酒酵母和大肠杆菌中异源功能表达。通过体内和体外酶活测定，证实该基因编码的蛋白催化(+)-胡薄荷酮C-9位羟基化生成(+)-薄荷呋喃，从而首次证明植物来源的薄荷呋喃合酶是一种P450单加氧酶。在薄荷高薄荷呋喃化学型精油中，薄荷呋喃约占20%，胡薄荷酮约占65%。重组酵母表达产物最高达2.1 nmol/ml细胞，大肠杆菌表达微体P450比含量为220 pmol/mg蛋白，酶活为0.5–1.4 nmol·h⁻¹·mg蛋白⁻¹。该cDNA全长1479核苷酸，编码493个氨基酸，与柠檬烯-3-羟化酶和柠檬烯-6-羟化酶分别有35%和38%的序列同一性。该工作明确了薄荷呋喃生物合成关键酶的性质和基因序列，为通过代谢工程调控薄荷精油中薄荷呋喃含量、改善精油品质提供了分子工具。

创新点

首次证明植物来源的薄荷呋喃合酶是细胞色素P450单加氧酶；克隆了该基因并异源表达；证实其与哺乳动物肝P450机制相似。

研究对象（7）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Mentha × piperita（胡椒薄荷）油腺分泌细胞 薄荷单萜生物合成 mw326 (+)-menthofuran synthase ((+)-pulegone-9-hydroxylase) 催化 从油腺cDNA文库克隆，编码P450单加氧酶
Saccharomyces cerevisiae WAT11U/WAT21U 异源表达 mw326 (+)-menthofuran synthase ((+)-pulegone-9-hydroxylase) 催化 在酵母中功能验证，WAT21U产物2.1±0.36 nmol/ml细胞
Escherichia coli JM109 异源表达 mw326 (+)-menthofuran synthase ((+)-pulegone-9-hydroxylase) 催化 N端修饰后表达，重组微体P450含量220 pmol/mg蛋白，产物8-10 nmol
Mentha × piperita（胡椒薄荷） 薄荷单萜生物合成 limonene-3-hydroxylase (-)-limonene-3-hydroxylase 催化 作为对照，不利用(+)-pulegone为底物
Mentha spicata（留兰香） 薄荷单萜生物合成 limonene-6-hydroxylase (-)-limonene-6-hydroxylase 催化 作为对照，不利用(+)-pulegone为底物
Saccharomyces cerevisiae WAT11U/WAT21U 电子传递 ATR1/ATR2 NADPH-cytochrome P450 reductase (from Arabidopsis thaliana) 能量供给 为P450提供电子，异源表达时共表达
Escherichia coli JM109 电子传递 无（外源添加） NADPH-cytochrome P450 reductase (from spearmint) 能量供给 体外重建系统中加入纯化的重组还原酶

关键发现

  1. M. pulegium高薄荷呋喃化学型精油中约20%薄荷呋喃和约65%胡薄荷酮
  2. 微体蛋白产量80±5 μg/g鲜重，P450比含量约0.75 pmol/μg蛋白，增溶后约1.8 pmol/μg蛋白
  3. 酶活0.5-1.4 nmol·h^-1·mg蛋白^-1
  4. cDNA全长1479核苷酸，编码493氨基酸，分子量55,360
  5. 与柠檬烯-3-羟化酶35%同一性，与柠檬烯-6-羟化酶38%同一性
  6. 酵母表达WAT11U产物0.86±0.26 nmol/ml细胞，WAT21U 2.1±0.36 nmol/ml
  7. 大肠杆菌表达重组酶产生8-10 nmol产物，微体P450含量220 pmol/mg蛋白
  8. EST文库中P450片段115个，其中mw326有21个代表，冗余度>15%。

研究结论

克隆的mw326编码(+)-薄荷呋喃合酶（(+)-胡薄荷酮-9-羟化酶），为P450单加氧酶，可用于转基因改良薄荷精油品质。