A Genetic and Biochemical Approach to Study Trichothecene Diversity in Fusarium sporotrichioides and Fusarium graminearum
- 作者
- Daren W. Brown, Susan P. McCormick, Nancy J. Alexander, Robert H. Proctor, Anne E. Desjardins
- 单位
- Mycotoxin Research Unit, USDA/ARS, National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois 61604
- 杂志
- Fungal Genetics and Biology（2001）
- DOI
- 10.1006/fgbi.2001.1256
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析Fusarium sporotrichioides和Fusarium graminearum中单端孢霉烯（trichothecene）生物合成基因簇的遗传组成与功能，解释两物种产生不同毒素（T-2 toxin与DON）的分子基础。
研究策略
对两个物种的trichothecene核心基因簇（约23 kb）进行测序和比较分析，预测新基因；通过基因破坏、前体饲喂实验验证基因功能；结合序列差异与化学表型关联分析。
核心内容
该研究通过比较遗传学与生物化学手段，系统解析了产毒真菌Fusarium sporotrichioides和Fusarium graminearum中单端孢霉烯生物合成基因簇的结构与功能，揭示了两物种产生T-2毒素与脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）差异的分子基础。研究重新测序了F. sporotrichioides的约22 kb基因簇，修正33处序列错误，并新发现TRI9与TRI10两个基因；同时首次完成F. graminearum基因簇全测序。两物种10个同源基因的蛋白序列一致性平均为85.4%，其中TRI8最低（76%）。基因破坏实验证实FsTRI7编码C-4乙酰化酶，其突变体只能积累HT-2毒素而无法合成T-2毒素；而FgTRI7因6个移码和终止密码子失活，解释了DON缺乏C-4氧化的原因。FsTRI8被证实参与C-8氧化/酯化，其突变体积累4,15-DAS。研究还发现TRI6结合位点在两物种中各有23个和19个，其中16个位置保守。这些结果支持trichothecene基因来自共同祖先的直系同源，基因失活是导致化学多样性的重要机制。
创新点
1. 完成并修正F. sporotrichioides基因簇序列，发现两个新基因TRI9和TRI10；2. 首次完成F. graminearum基因簇的完整测序；3. 通过比较基因组学预测并证实FgTRI7为假基因；4. 通过基因破坏实验首次证明FsTRI7编码C-4乙酰化酶、FsTRI8参与C-8氧化/酯化；5. 提出基因失活是trichothecene化学多样性的重要机制。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299; Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | TRI5 | Trichodiene synthase | 催化 | 催化法尼基焦磷酸环化生成trichodiene；FgTRI5与FsTRI5蛋白一致性91% |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299; Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | TRI4 | Cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 催化trichodiene氧化为2-羟基trichodiene；两物种蛋白一致性87% |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299; Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | TRI11 | Cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 催化C-15羟基化；两物种蛋白一致性90% |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299; Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | TRI3 | Acetyl esterase (15-O-acetyltransferase) | 催化 | 催化C-15乙酰化；两物种蛋白一致性76% |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299 | trichothecene biosynthesis | FsTRI7 | Acetyl esterase (C-4 acetylase) | 催化 | 催化C-4乙酰化；基因破坏突变体ΔFsTRI7积累HT-2 toxin |
| Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | FgTRI7 | Nonfunctional protein (pseudogene) | — | 因6个移码和终止密码子等突变失活；与DON不产生C-4氧化修饰一致 |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299; Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | TRI8 | Esterase/oxygenase (lipase-like) | 催化 | 参与C-8氧化/酯化，具体作用未知；ΔFsTRI8积累4,15-DAS；两物种蛋白一致性76% |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299; Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | TRI6 | Transcriptional activator (Cys2His2 zinc finger) | 调控 | 调控trichothecene基因表达；两物种蛋白一致性86% |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299; Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | TRI12 | Efflux pump | 转运 | 编码trichothecene外排泵蛋白；两物种蛋白一致性78% |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299; Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | TRI10 | Unknown | — | 新鉴定基因，预测蛋白420 aa，含内含子；功能未知；启动子无TRI6结合位点 |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299; Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | TRI9 | Unknown | — | 新鉴定基因，预测蛋白43 aa；功能未知 |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299; Fusarium graminearum GZ3639 | trichothecene biosynthesis | TRI101 | 3-O-acetyltransferase | 催化 | 位于基因簇外；催化C-3乙酰化；两物种等位基因一致性>99% |
关键发现
- 重新测序了F. sporotrichioides的trichothecene基因簇（22,037 bp），修正了33处序列错误
- 预测了新基因TRI9（编码43个氨基酸蛋白）和TRI10（编码420个氨基酸蛋白，含一个内含子）。比较两个物种的10个同源基因，蛋白序列一致性平均为85.4%，核苷酸一致性平均为84.6%，其中TRI9一致性最高（蛋白97%，核苷酸92%），TRI8最低（蛋白76%，核苷酸82%）。F. graminearum的TRI7因多个移码（6个）和终止密码子而失活，与其不产生C-4氧化修饰的DON一致。基因破坏实验表明，ΔFsTRI7突变体积累HT-2 toxin而无法产生T-2 toxin，证实FsTRI7编码C-4乙酰化酶
- ΔFsTRI8突变体积累4,15-DAS，证实FsTRI8参与C-8氧化/酯化。前体饲喂显示ΔFsTRI7可将4,15-DAS和3,4,15-TAS转化为T-2 toxin，但不能转化15-MAS等
- ΔFsTRI8可将HT-2转化为T-2 toxin，但不能转化T-2 tetraol。此外，TRI6结合位点在F. sporotrichioides中有23个，在F. graminearum中有19个，其中16个位置保守
- TRI10启动子无TRI6结合位点。F. graminearum不同菌株间，TRI6/11/12编码序列一致性为90-95%，而TRI101一致性>99%。内含子平均长度60 bp（49-90 bp），内部基序第4位T和第6位A保守。
研究结论
通过比较遗传学与生物化学方法，阐明了F. sporotrichioides和F. graminearum中trichothecene生物合成基因的结构与功能。FsTRI7是C-4乙酰化酶，而FgTRI7因突变失活，解释了DON缺乏C-4氧化的原因；FsTRI8参与C-8修饰，具体作用仍需进一步研究。研究支持trichothecene基因来自共同祖先的直系同源，基因失活是导致化学多样性的机制之一。