Use of the Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase Promoter for Production of Functional Mammalian Membrane Transport Proteins in the Yeast Pichia pastoris
- 作者
- Frank Döring, Maja Klapper, Stephan Theis, Hannelore Daniel
- 单位
- Institute of Nutritional Sciences, University of Giessen, Wilhelmstrasse 20, D-35392 Giessen, Germany
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（1998）
- DOI
- 10.1006/bbrc.1998.9342
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在毕赤酵母中高效表达功能性哺乳动物膜转运蛋白，比较组成型启动子P_GAP与诱导型启动子P_AOX1的表达效果。
研究策略
利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子（P_GAP）实现组成型表达，构建rPEPT2和hPEPT1的重组毕赤酵母菌株，并通过^3H-D-Phe-Ala摄取实验评估功能表达水平。
核心内容
本研究在毕赤酵母GS115中利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（P_GAP）实现了哺乳动物膜转运蛋白rPEPT2和hPEPT1的组成型高水平表达，并与传统甲醇诱导型启动子P_AOX1进行了系统比较。通过构建重组菌株并结合³H-D-Phe-Ala摄取实验评估功能表达水平，结果显示GAP-rP2克隆对底物的摄取速率比对照高140倍，rPEPT2介导的转运在pH 6.5~7.0时活性最优，表观K0.5为0.122±0.012 mM。在葡萄糖复杂培养基（YPD）中，P_GAP驱动的rPEPT2其Vmax达3.34±0.20 nmol/OD/30min，约为P_AOX1驱动（0.60±0.03）的5.6倍；hPEPT1在P_GAP下的Vmax为5.65±0.19 nmol/OD/30min，是P_AOX1（0.65±0.07）的约8.7倍。此外，不同碳源对表达影响显著，以葡萄糖最高、甲醇最低。研究表明P_GAP启动子可替代P_AOX1，实现功能性哺乳动物膜蛋白在毕赤酵母中的高效组成型表达，有效规避甲醇诱导的复杂性。
创新点
首次在毕赤酵母中利用P_GAP组成型表达功能性整合膜蛋白，避免了甲醇诱导的复杂性，且表达水平显著优于P_AOX1。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 肽转运 | rPEPT2 | rPEPT2 | 转运 | 大鼠肾肽转运蛋白，729个氨基酸，12个推定跨膜结构域，高亲和力型 |
| Pichia pastoris GS115 | 肽转运 | hPEPT1 | hPEPT1 | 转运 | 人肠肽转运蛋白，708个氨基酸，低亲和力型 |
| Pichia pastoris GS115 | 异源表达调控 | GAPDH启动子（P_GAP） | — | 调控 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，组成型强启动子，受碳源调控 |
| Pichia pastoris GS115 | 异源表达调控 | AOX1启动子（P_AOX1） | — | 调控 | 醇氧化酶1基因启动子，甲醇诱导型，需严格控制甲醇浓度和诱导时间 |
关键发现
- 构建的GAP-rP2克隆对^3H-D-Phe-Ala的摄取速率比对照高140倍
- rPEPT2介导的摄取在pH 6.5~7.0时最优，表观K0.5为0.122±0.012 mM
- P_GAP驱动的rPEPT2在葡萄糖复杂培养基（YPD）中Vmax为3.34±0.20 nmol/OD/30min，是P_AOX1（0.60±0.03）的约5.6倍
- P_GAP驱动的hPEPT1在YPD中Vmax为5.65±0.19 nmol/OD/30min，而P_AOX1为0.65±0.07，约8.7倍
- 不同碳源（葡萄糖、甘油、甲醇）下表达水平差异显著，葡萄糖最高，甲醇最低。
研究结论
P_GAP启动子可有效用于毕赤酵母中哺乳动物膜转运蛋白的高水平组成型表达，产量优于传统P_AOX1，是替代P_AOX1的理想选择。