Cloned Prokaryotic Iron Superoxide Dismutase Protects Yeast Cells against Oxidative Stress Depending on Mitochondrial Location
- 作者
- Rena Balzan, Dolores R. Agius, William H. Bannister
- 单位
- Department of Physiology and Biochemistry, University of Malta, Msida MSD 06, Malta
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（1999）
- DOI
- 10.1006/bbrc.1999.0285
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
探究酵母细胞中线粒体超氧自由基的产生位置，以及将大肠杆菌FeSOD靶向线粒体膜间隙或基质对MnSOD缺陷酵母氧化应激保护作用的影响
研究策略
构建携带酵母细胞色素c1前导序列的大肠杆菌FeSOD基因重组质粒，将其导入MnSOD缺陷酵母菌株，使FeSOD靶向线粒体膜间隙，并与靶向线粒体基质的FeSOD菌株及空载体对照菌株比较生长速率、抗氧化酶活性和氧化应激耐受性
研究路线图
核心内容
该研究将大肠杆菌铁超氧化物歧化酶（FeSOD）分别靶向至MnSOD缺陷型酵母的线粒体膜间隙或基质，以探究线粒体超氧自由基的产生部位及不同区室SOD的生理功能。结果显示，靶向膜间隙的FeSOD活性为5.9 U/mg，而靶向基质的FeSOD在线粒体中活性高达62.8 U/mg。在无氧化胁迫的最小培养基中，膜间隙定位的FeSOD虽能提高菌株生长速率，但远不及基质定位菌株；在1 mM百草枯或6 mM百草枯处理下，膜间隙定位FeSOD完全丧失保护作用，且不能恢复乙醇非发酵碳源上的生长。此外，膜间隙FeSOD菌株的过氧化氢酶活性（17.9 U/mg）显著低于基质定位菌株（55.8 U/mg）。研究证实酵母线粒体超氧自由基主要产生于内膜基质侧，膜间隙仅有少量产生，其清除虽对细胞有益，但不足以替代基质SOD抵御诱导性氧化应激。这一发现为线粒体ROS产生位点提供了直接实验证据，对理解SOD亚细胞定位在抗氧化防御中的分工具有重要意义。
创新点
首次将原核FeSOD靶向酵母线粒体膜间隙，证明膜间隙定位的FeSOD虽能在最小培养基中提高生长速率，但无法替代基质MnSOD抵御诱导氧化应激，为超氧自由基主要在线粒体内膜基质侧产生提供了直接实验证据
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae DL1Mn (sod2::LEU2 MnSOD缺陷菌株) | 活性氧清除/超氧化物歧化 | sodB (Escherichia coli FeSOD) | FeSOD | 催化 | 靶向线粒体膜间隙时活性为5.9 U/mg，靶向基质时活性为62.8 U/mg |
| Saccharomyces cerevisiae DL1Mn | 活性氧清除/超氧化物歧化 | SOD2 (酵母MnSOD) | MnSOD | 催化 | 该菌株中SOD2基因被LEU2破坏，导致MnSOD缺失 |
| Saccharomyces cerevisiae DL1Mn-YEp-C1F | 线粒体蛋白靶向 | CYC1 (细胞色素c1前导序列编码基因) | 细胞色素c1前导肽 | 区室化 | 用于引导FeSOD进入线粒体膜间隙，翻译后被切除 |
| Saccharomyces cerevisiae DL1Mn | 过氧化氢清除 | — | Catalase (CAT) | 催化 | DL1Mn Fe+-P中CAT活性升高至55.8 U/mg，表明CAT控制H2O2水平 |
| Saccharomyces cerevisiae DL1Mn | 过氧化氢清除 | — | Cytochrome c peroxidase (CCP) | 催化 | IMS靶向FeSOD菌株中CCP活性升高至1.50 U/mg |
关键发现
- 靶向线粒体膜间隙的FeSOD在DL1Mn-YEp-C1F细胞中活性为5.9±0.72 U/mg总蛋白，而靶向基质的DL1Mn Fe+-P细胞中FeSOD线粒体活性为62.8±2.45 U/mg，胞质活性为19.91±1.69 U/mg。DL1Mn Fe+-P细胞CAT活性为55.8±3.4 U/mg，显著高于DL1Mn-YEp-C1F的17.9±1.3 U/mg和对照的18.2±2.5 U/mg。在无百草枯的最小培养基中，FeSOD靶向IMS的菌株生长速率优于空载体对照，但低于靶向基质的菌株
- 在1 mM百草枯或6 mM百草枯存在时，IMS靶向FeSOD无保护作用。在非发酵碳源乙醇培养基中，IMS靶向FeSOD不能恢复生长。在1-6 mM甲萘醌处理下，IMS靶向菌株存活率与对照无差异。双突变体（MnSOD和Cu,ZnSOD缺陷）携带IMS-FeSOD在95小时时生长速率比仅携带质粒的双突变体增加53%，但在1 mM百草枯下均不能存活。
研究结论
酵母线粒体超氧自由基主要产生于线粒体内膜的基质侧，但膜间隙也有少量超氧自由基产生，其被SOD清除对细胞有益。靶向线粒体膜间隙的FeSOD仅能在生理条件下提供部分保护，而抵抗诱导氧化应激和非发酵碳源生长必须依赖基质定位的SOD。