Engineering of a Manganese-Binding Site in Lignin Peroxidase Isozyme H8 from Phanerochaete chrysosporium
- 作者
- Tünde Mester, Ming Tien
- 单位
- Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania 16802
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（2001）
- DOI
- 10.1006/bbrc.2001.5015
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
木质素过氧化物酶（LP）缺乏锰结合位点，无法氧化Mn2+，而锰过氧化物酶（MnP）可以；本研究试图通过蛋白质工程在LP中构建锰结合位点，使其获得Mn2+氧化能力，探究底物特异性是否仅由底物结合位点决定。
研究策略
以MnP H4的Mn2+结合位点（Glu35、Glu39、Asp179）为模板，在重组LP同工酶H8中通过定点突变引入三个氨基酸替换（Asn182Asp、Asp183Lys、Ala36Glu），构建阴离子锰结合位点，并测定突变体的稳态动力学参数。
研究路线图
核心内容
该研究通过蛋白质工程在木质素过氧化物酶同工酶H8中构建锰结合位点，以探究底物特异性是否仅由底物结合位点决定。研究者以锰过氧化物酶H4的锰结合位点为模板，在重组LPH8中引入Asn182Asp、Asp183Lys和Ala36Glu三个定点突变，形成阴离子锰结合位点。结果表明，三重突变体A36E/N182D/D183K获得了锰氧化活性，其Km(Mn²⁺)为1.57 mM，kcat为5.45 s⁻¹，催化效率为3.4×10³ M⁻¹·s⁻¹，而野生型及单突变、双突变体均无此活性。突变体保留了对藜芦醇的氧化能力，其Km(VA)为0.29 mM，kcat为1.1 s⁻¹。这证明在LP中引入MnP的锰结合位点足以赋予其锰氧化功能，揭示LP与MnP底物特异性的关键结构差异在于锰结合位点的有无，并为过氧化物酶双功能性与进化提供了结构基础。
创新点
首次在木质素过氧化物酶中通过设计锰结合位点成功构建出具有Mn2+氧化活性的双功能酶；支持了双功能过氧化物酶进化中'基因共享'模型的预测。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21 | 木质素降解 | LPH8 (ML-1) | 木质素过氧化物酶同工酶H8（rLPH8） | 催化 | 通过定点突变引入Asn182Asp、Asp183Lys、Ala36Glu三个突变，构建锰结合位点 |
| Phanerochaete chrysosporium | 木质素降解 | MnP H4 | 锰过氧化物酶同工酶H4（MnP H4） | 催化 | 作为对照，其天然锰结合位点由Glu35、Glu39、Asp179组成 |
| Phanerochaete chrysosporium | 木质素降解 | lp (H8) | Trp171 | 催化 | 参与藜芦醇等芳香底物的长程电子传递，在突变体中保留 |
关键发现
- 成功构建的三重突变体（A36E/N182D/D183K）能够氧化Mn2+，其Km(Mn2+)为1.57 mM，kcat为5.45 s-1，催化效率kcat/Km为3.4×10^3 M-1·s-1
- 而野生型rLPH8、单突变A36E和双突变N182D/D183K均无Mn2+氧化活性。突变体保留藜芦醇氧化能力，Km(VA)为0.29 mM，kcat为1.1 s-1，kcat/Km为3.8×10^3 M-1·s-1
- 野生型rLPH8对应Km为0.19 mM，kcat为2.2 s-1。突变体对H2O2的Km降至0.006 mM（野生型0.021 mM），但kcat/Km相近。突变体氧化藜芦醇和Mn2+的pH最适值均比野生型高约1个pH单位。
研究结论
在LP中引入MnP的Mn2+结合位点（三个酸性残基）足以赋予其Mn2+氧化活性，证明LP与MnP之间底物特异性的主要结构差异是锰结合位点的有无；创建替代底物结合位点可形成长程电子传递途径，为理解过氧化物酶双功能性和进化提供了结构基础。