Highly Efficient Biotransformation of Astragaloside IV to Cycloastragenol by Sugar-Stimulated β-Glucosidase and β-Xylosidase from Dictyoglomus thermophilum
- 作者
- Qi Li, Tao Wu, Linguo Zhao, Jianjun Pei, Zhenzhong Wang, Wei Xiao
- 单位
- College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University; Jiangsu Key Lab for the Chemistry and Utilization of Agricultural and Forest Biomass; Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd.
- 杂志
- Journal of Microbiology and Biotechnology（2018）
- DOI
- 10.4014/jmb.1807.07020
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
高效、绿色地将黄芪甲苷IV (ASI) 转化为更具药理活性的环黄芪醇 (CAG)，避免传统化学法（Smith降解法、酸水解）的污染和低选择性，以及微生物转化法耗时和选择性低的问题。
研究策略
从嗜热菌 Dictyoglomus thermophilum 中克隆表达β-葡萄糖苷酶Dth3和β-木糖苷酶Xln-DT，利用它们对ASI的C-6位葡萄糖和C-3位木糖的特异性切割，协同酶转化制备CAG；并通过单因素实验优化温度、pH和酶量。
核心内容
针对黄芪甲苷IV化学水解制备环黄芪醇存在的污染严重、选择性低等问题，研究者从嗜热菌Dictyoglomus thermophilum中克隆并异源表达了热稳定的β-葡萄糖苷酶Dth3和β-木糖苷酶Xln-DT，通过二者协同作用特异性切割黄芪甲苷IV C-6位葡萄糖和C-3位木糖，实现环黄芪醇的绿色高效制备。研究发现Dth3对葡萄糖高度耐受，在1 M葡萄糖下活性完全不受影响，2.5 M葡萄糖下仍保留60%活性，而Xln-DT在1 M葡萄糖和0.3 M木糖下活性分别提高2.13倍和1.29倍。经单因素优化，在75°C、pH 5.5条件下，采用1 U Dth3和0.2 U Xln-DT处理1 g/L黄芪甲苷IV，3小时内可生成0.63 g/L环黄芪醇，摩尔转化率达94.5%，且中间产物黄芪皂苷B在1小时内即实现100%摩尔转化。该方法利用耐糖酶特性克服了产物抑制，具有高选择性、环保和高效的特点，为工业化制备高价值环黄芪醇提供了全新酶法路线。
创新点
首次报道来自Dictyoglomus thermophilum的热稳定且耐糖的β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶协同水解ASI；Dth3对葡萄糖高度耐受(Ki约3 M)，Xln-DT受葡萄糖和木糖激活；建立了绿色高效的CAG制备方法，3小时内摩尔转化率94.5%。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | 黄芪甲苷IV生物转化 | dth3 | β-葡萄糖苷酶Dth3 | 催化 | GH3家族，水解ASI C-6位葡萄糖，对葡萄糖高度耐受（Ki约3 M） |
| E. coli BL21(DE3) | 黄芪甲苷IV生物转化 | xln-DT | β-木糖苷酶Xln-DT | 催化 | GH39家族，水解ASI C-3位木糖，受葡萄糖和木糖激活，1 M葡萄糖下活性提高2.13倍 |
关键发现
- Dth3在1 M葡萄糖下活性不受影响，2.5 M葡萄糖下保留60%活性；3 M木糖下活性保持100%；Xln-DT在1 M葡萄糖下活性提高2.13倍，0.3 M木糖下提高1.29倍；优化条件下(75°C, pH
- 5, 1 U Dth3
- 2 U Xln-DT, 200 μl体系)，1 g/L ASI在3 h内转化为0.63 g/L CAG，摩尔转化率94.5%；1 h内ASI完全转化为Cyc B，产生0.79 g/L Cyc B，摩尔转化率100%。
研究结论
本文首次利用来自Dictyoglomus thermophilum的热稳定、耐糖的β-葡萄糖苷酶Dth3和β-木糖苷酶Xln-DT协同水解ASI，实现了高选择性、环保、经济高效的CAG生产，为制药工业提供新方法。