Functional Expression of the Uncomplexed Serum Retinol-binding Protein in Escherichia coli: Ligand Binding and Reversible Unfolding Characteristics
- 作者
- Holger N. Müller, Arne Skerratt
- 单位
- Max-Planck-Institut f. Biophysik, Heinrich-Hoffmann-Str. 7, W-6000 Frankfurt am Main 71, Germany
- 杂志
- Journal of Molecular Biology（1993）
- DOI
- 10.1006/jmbi.1993.1194
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在大肠杆菌中功能性表达未结合配体的血清视黄醇结合蛋白，并研究其配体结合与折叠稳定性
研究策略
利用OmpA信号肽将重组RBP分泌至大肠杆菌周质，共表达蛋白二硫键异构酶(PDI)和肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)辅助折叠，并以N-乙酰-L-半胱氨酸作为辅底物，通过金属螯合亲和色谱一步纯化
核心内容
该研究首次实现了脂笼蛋白家族成员血清视黄醇结合蛋白（RBP）在大肠杆菌中的功能性表达。研究者利用OmpA信号肽将重组RBP分泌至周质空间，同时共表达蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶辅助折叠，并添加N-乙酰-L-半胱氨酸作为辅底物，通过金属螯合亲和色谱一步纯化获得无配体蛋白。结果显示，重组蛋白产量约0.15 mg/L培养物，与视黄酸的解离常数Kd'为0.21±0.03 μM，与天然人RBP的2.1×10^-7 M完全一致；配体饱和时色氨酸荧光淬灭77%。在盐酸胍诱导的展开实验中，apo-RBP和holo-RBP均呈现单一转变，中点浓度分别为2.0 M和2.4 M，对应折叠自由能ΔG°(n-u)为31.4±2.5 kJ/mol和41.3±2.7 kJ/mol，表明配体结合显著增强了折叠稳定性。该工作证明借助周质分泌和折叠辅助因子，大肠杆菌体系能够生产功能正常且稳定的无配体脂笼蛋白，为其他家族成员的异源表达和配体结合机制研究奠定了基础。
创新点
首次实现脂笼蛋白家族成员在大肠杆菌中的功能性表达；通过共表达折叠辅助因子和添加硫醇试剂解决细胞毒性和蛋白异构体问题；表明apo-RBP可稳定折叠
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM83 | 重组蛋白表达与折叠 | RBP | 血清视黄醇结合蛋白（RBP） | 转运 | 猪源RBP，融合OmpA信号肽和C端六聚组氨酸标签，分泌至周质并以apo形式纯化 |
| Escherichia coli JM83 | 蛋白分泌 | ompA | OmpA信号肽 | 转运 | 引导RBP跨膜分泌至周质，信号肽在成熟蛋白N端被正确切除 |
| Escherichia coli JM83 | 辅助折叠 | pdi | 蛋白二硫键异构酶（PDI） | 催化 | 由pASK61共表达，促进RBP二硫键正确形成，与N-乙酰-L-半胱氨酸共同作用 |
| Escherichia coli JM83 | 辅助折叠 | ppi | 肽基脯氨酰顺反异构酶（PPI） | 催化 | 由pASK61共表达，促进脯氨酰肽键异构化，辅助RBP折叠 |
| Escherichia coli JM83 | 基因表达调控 | lac promoter/operator, lacI | Lac阻遏蛋白 | 调控 | IPTG诱导RBP表达，lacI编码阻遏蛋白调控lac启动子/操纵子 |
关键发现
- 重组RBP产量约0.15 mg/L培养物（A550=1.3）
- 与视黄酸的解离常数Kd'=0.21±0.03 μM（与天然人RBP的2.1×10^-7 M完全一致）
- 配体饱和时色氨酸荧光淬灭77%
- Gdn·HCl诱导展开显示单一转变，apo-RBP中点浓度2.0 M，holo-RBP为2.4 M
- apo-RBP的ΔG°(n-u)=31.4±2.5 kJ/mol，holo-RBP为41.3±2.7 kJ/mol，配体结合显著增加折叠稳定性
研究结论
通过周质分泌并借助折叠辅助因子，可以在大肠杆菌中获得功能正常且稳定的无配体血清视黄醇结合蛋白，该方法应适用于其他脂笼蛋白家族成员的表达，为蛋白质工程研究配体结合奠定了基础