Low-Copy Plasmids can Perform as Well as or Better Than High-Copy Plasmids for Metabolic Engineering of Bacteria
- 作者
- Kristala L. Jones, Seon-Won Kim, J. D. Keasling
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley, California 94720-1462
- 杂志
- Metabolic Engineering（2000）
- DOI
- 10.1006/mben.2000.0161
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
高拷贝质粒虽能高效表达基因，但常导致代谢负担，降低整体产物产量。需要评估低拷贝质粒是否能在代谢工程中达到相当或更好的性能。
研究策略
构建携带 ppk 或 dxs 基因的低拷贝 mini-F 质粒和高拷贝 pMB1 质粒，分别转化大肠杆菌，比较聚磷酸盐（polyP）和番茄红素的产量、细胞密度及代谢负担。
研究路线图
核心内容
本研究系统比较了低拷贝mini-F质粒与高拷贝pMB1质粒在大肠杆菌代谢工程中的表现。作者将ppk或dxs基因分别构建于两类质粒中，转化大肠杆菌后比较聚磷酸盐和番茄红素的产量、细胞密度及代谢负担。结果显示，在聚磷酸盐合成中，低拷贝质粒使稳定期单位细胞polyP含量从约120 μmol/g DCW增至约220 μmol/g DCW，总产物浓度较对照提高69%，而高拷贝质粒仅提高31%；高拷贝质粒培养物的稳定期细胞密度比低拷贝低约24%。在番茄红素合成中，无诱导条件下低拷贝质粒使产量提高2.9倍，优于高拷贝的2.4倍，且添加IPTG后高拷贝质粒严重抑制细胞生长而低拷贝无影响。研究表明，当重组途径消耗ATP、甘油醛-3-磷酸等必需代谢物时，低拷贝质粒能显著减轻代谢负担，实现与高拷贝相当甚至更高的总产物浓度，并能通过可调控启动子实现精细基因表达调节，为代谢工程中质粒选择提供了重要依据。
创新点
系统比较低拷贝 mini-F 质粒与高拷贝质粒在代谢工程中的应用效果；证明低拷贝质粒可显著降低代谢负担，并在总产物浓度上优于高拷贝质粒；展示低拷贝质粒结合可调控启动子可实现精细调节。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH10B | 聚磷酸盐合成 | ppk | polyP激酶(PPK) | 催化 | 通过低拷贝pF12-ppk和高拷贝pSVD8表达，增强polyP积累 |
| Escherichia coli DPA1 (ppk::kan) | 聚磷酸盐合成 | ppk | polyP激酶(PPK) | 催化 | ppk/ppx突变株中表达pSVD8，用于验证polyP降解机制 |
| Escherichia coli DH10B | 聚磷酸盐降解 | ppx | poly磷酸酶(PPX) | 催化 | 内源ppx与ppk共操纵子，参与polyP降解 |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素合成（非甲羟戊酸IPP途径） | dxs | DXP合酶(DXS) | 催化 | 低拷贝pF3-dxs/pF12-dxs和高拷贝pK1-dxs表达，增强lycopene |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素合成 | crtE, crtB, crtI | CrtE, CrtB, CrtI | 催化 | 来自Erwinia herbicola，质粒pAC-LYC04表达 |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素合成 | ipi | IPP异构酶 | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis，质粒pAC-LYC04表达 |
| Escherichia coli DH10B/DH5α | 基因表达调控 | araC | AraC调控蛋白 | 调控 | 控制PBAD启动子，用于诱导ppk/dxs表达 |
| Escherichia coli DH5α | 基因表达调控 | lacIq | LacI阻遏蛋白 | 调控 | 控制Ptac启动子，用于pK1-dxs和pF3-dxs中 |
关键发现
- 聚磷酸盐方面：低拷贝（pF12-ppk）和高拷贝（pSVD8）质粒均使稳定期单位细胞 polyP 含量从约120 μmol/g DCW增至约220 μmol/g DCW（约80%增强）。高拷贝质粒培养物稳定期细胞密度比低拷贝低约24%，比对照低30%
- 总体产物浓度低拷贝约160 μmol/L，高拷贝约130 μmol/L，对照约97 μmol/L。3h时低拷贝 polyP 达2.8 μmol/g DCW，对照仅0.1 μmol/g DCW（20倍），24h时低拷贝为219 μmol/g DCW，对照为120 μmol/g DCW。高拷贝 pSVD8 在3h时 polyP 高达909 μmol/g DCW，但24h降至223 μmol/g DCW
- 在 ppk/ppx 突变菌株 DPA1 中也观察到类似下降，说明下降并非 PPX 所致。24h时低拷贝 PPK 活性为527 U/μg蛋白，高拷贝为457，对照为145。低拷贝质粒使总产物浓度较对照提高69%，高拷贝仅提高31%。番茄红素方面：无IPTG时，高拷贝 pK1-dxs 和低拷贝 pF3-dxs 分别比对照提高2.4倍和2.9倍
- 添加IPTG后高拷贝培养物细胞生长和产量大幅下降，低拷贝无影响。低拷贝 pF12-dxs 在阿拉伯糖诱导下，产量随浓度增加，1.33mM时比无诱导提高2.8倍，且细胞生长不受影响
- 高拷贝 pDdxs 在13.3mM时产量比 pF12-dxs 高30%，但拷贝数约130 vs 1-2，低拷贝质粒的质粒特异性表达更高。
研究结论
低拷贝 mini-F 质粒在代谢工程中可以与高拷贝质粒表现相当甚至更好，特别是当重组途径消耗细胞正常代谢必需的底物（如 ATP、甘油醛-3-磷酸、丙酮酸）时，低拷贝质粒能减轻代谢负担，实现更高或相当的总体产物浓度，并可通过紧凑调控的启动子精确调控基因表达。