Metabolic Flux Analysis of Escherichia coli Deficient in the Acetate Production Pathway and Expressing the Bacillus subtilis Acetolactate Synthase
- 作者
- Yea-Tyng Yang, Aristos A. Aristidou, Ka-Yiu San, George N. Bennett
- 单位
- Department of Bioengineering and Chemical Engineering, Institute of Biosciences and Bioengineering, Rice University; VTT Biotechnology and Food Research; Department of Biochemistry and Cell Biology, Institute of Biosciences and Bioengineering, Rice University
- 杂志
- Metabolic Engineering（1999）
- DOI
- 10.1006/mben.1998.0103
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何减少大肠杆菌培养中乙酸积累，并系统分析宿主现有途径的微小扰动对碳通量再分布的影响
研究策略
构建ackA-pta缺失突变株，并表达枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶(ALS)，利用代谢通量分析(MFA)研究丙酮酸和乙酰-CoA分支点的碳通量分布
研究路线图
核心内容
该研究以大肠杆菌GJT001为底盘，通过敲除乙酸生成途径关键基因ackA-pta构建突变株YBS125，并异源表达枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶（ALS），结合代谢通量分析（MFA）定量考察丙酮酸和乙酰-CoA分支点的碳通量再分布。结果显示，单独敲除ackA-pta使乳酸生成速率大幅上升，特异性生长速率从亲本的1.41 h⁻¹降至0.54 h⁻¹，但最终细胞密度高出30%以上；在此基础上表达ALS，乙酸和乳酸积累均降低约4倍，其中乳酸通量v7从8.29 mmol/g-cell h骤降至0.14，乙酸通量v11在YBS125背景中从0.15进一步降至0.08，细胞密度恢复到与亲本相当水平。通量分析揭示，单一途径的遗传扰动会通过细胞内代谢物浓度（尤其是丙酮酸）的波动引起其他分支通量的深刻变化，而ALS在ackA-pta缺失背景下仍能高效竞争丙酮酸，说明宿主现有反应网络的可塑性对代谢工程改造具有决定性影响，为理性设计碳通量重定向提供了依据。
创新点
将ackA-pta缺失与异源ALS表达相结合，发现ALS在ackA-pta背景下仍能有效竞争丙酮酸，并揭示细胞内中间代谢物浓度（如丙酮酸）在通量重分布中的重要性
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli GJT001 | 乙酸生成途径 | ackA | 乙酸激酶 | 催化 | 乙酸生成途径关键酶，本研究构建其缺失突变 |
| Escherichia coli GJT001 | 乙酸生成途径 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 乙酸生成途径关键酶，与ackA同时缺失 |
| Escherichia coli YBS125 (ackA-pta缺失突变体) | 丙酮酸代谢 | alsS | 乙酰乳酸合酶（来自Bacillus subtilis） | 催化 | 异源表达，将丙酮酸转化为乙酰乳酸，减少乙酸积累 |
| Escherichia coli 野生型及突变株 | 丙酮酸分支点 | pfl | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 丙酮酸到乙酰-CoA的主流分支，与ALS竞争丙酮酸 |
| Escherichia coli 野生型及突变株 | 乳酸生成途径 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 催化丙酮酸生成乳酸，在ackA-pta突变株中通量显著增加 |
关键发现
- ALS表达使乙酸和乳酸积累降低约4倍
- 碳通量到乙酸（v11）减少超过60%
- ackA-pta突变株乳酸生成速率大幅增加，甲酸、乙醇、氢产量降低
- ackA-pta突变株特异性生长速率为0.54 h^-1，亲本为1.41 h^-1，最终OD高出30%以上
- ackA-pta+ALS组合乙酸水平最小，细胞密度与亲本相似。通量分析显示YBS125（ackA-pta）宿主单独时乳酸通量v7为8.29 mmol/g-cell h，加ALS后降至0.14
- 乙酸通量v11在GJT001宿主单独为3.03，加ALS降至1.11，在YBS125中为0.15，加ALS后进一步降至0.08。
研究结论
宿主细胞现有反应网络在精确遗传扰动下对代谢通量再分布起重要作用，一条通路的扰动可能对其他通路产生深远影响；细胞内核苷酸中间代谢物（尤其是丙酮酸）的浓度在重定向代谢通量中具有重要性。