Optimization of Ethanol Production in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Engineering of the Ammonium Assimilation
- 作者
- Torben L. Nissen, Morten C. Kielland-Brandt, Jens Nielsen, John Villadsen
- 单位
- Department of Yeast Genetics, Carlsberg Laboratory; Department of Biotechnology, Technical University of Denmark
- 杂志
- Metabolic Engineering（2000）
- DOI
- 10.1006/mben.1999.0140
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
厌氧发酵中甘油形成消耗碳源并降低乙醇产率，如何通过代谢工程改变铵同化途径的辅因子需求，减少NADH过剩并增加ATP消耗，从而降低甘油产量、提高乙醇产量。
研究策略
在酿酒酵母中敲除NADPH依赖的谷氨酸脱氢酶基因GDH1，同时过表达谷氨酰胺合成酶基因GLN1和谷氨酸合酶基因GLT1，使铵同化从NADPH消耗途径转变为NADH和ATP消耗途径，从而减少甘油形成并促进乙醇生成。
研究路线图
核心内容
本研究在酿酒酵母中通过改造铵同化途径的辅因子需求来优化乙醇生产。传统厌氧发酵中，甘油生成消耗碳源并降低乙醇产率，其根源在于NADH过剩。作者采用代谢工程策略，敲除NADPH依赖的谷氨酸脱氢酶基因GDH1，同时过表达谷氨酰胺合成酶基因GLN1和谷氨酸合酶基因GLT1，使铵同化从消耗NADPH转变为消耗NADH和ATP，从而减少甘油形成。构建的菌株TN19在厌氧批式发酵中乙醇产率从0.480提高至0.531 C-mol/C-mol葡萄糖，较野生型提高10%，甘油产率从0.097降至0.060 C-mol/C-mol葡萄糖，降低38%，同时最大比生长速率保持为野生型的约90%。该策略通过改变辅因子平衡而非直接敲除甘油合成基因，在维持良好生长性能的同时显著提升乙醇产率，验证了通过改造生物质合成途径的辅因子需求来优化发酵产品的可行性。
创新点
['以铵同化途径的辅因子工程替代直接敲除甘油合成基因的策略', '通过改变辅因子平衡同时降低甘油产量并提高乙醇产量', '构建了菌株TN19成功实现乙醇产率提高10%、甘油产率降低38%']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 铵同化途径 | GDH1 | NADPH依赖性谷氨酸脱氢酶Gdh1p | 催化 | 野生型中主要催化2-酮戊二酸+NH4+ + NADPH生成谷氨酸，在改造菌株中被删除 |
| Saccharomyces cerevisiae | 铵同化途径 | GLN1 | 谷氨酰胺合成酶Gln1p | 催化 | 过表达后催化谷氨酸+NH4+ + ATP生成谷氨酰胺，引入ATP消耗 |
| Saccharomyces cerevisiae | 铵同化途径 | GLT1 | 谷氨酸合酶Glt1p | 催化 | 过表达后催化2-酮戊二酸+谷氨酰胺+NADH生成2分子谷氨酸，引入NADH消耗 |
| Saccharomyces cerevisiae | 铵同化途径 | GDH2 | NADH依赖性谷氨酸脱氢酶Gdh2p | 催化 | 在TN22中过表达，催化谷氨酸脱氢生成2-酮戊二酸和NH4+，可用于NADH消耗，但无ATP消耗 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解/甘油合成 | GPD1, GPD2 | 甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 背景讨论中提及的甘油合成酶，未直接在本文改造 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | PGK1 | 磷酸甘油酸激酶 | 调控 | 其强组成型启动子用于过表达GLN1、GLT1和GDH2 |
关键发现
- 菌株TN19（gdh1Δ PGK1p-GLT1 PGK1p-GLN1）在厌氧批式发酵中乙醇产率较野生型提高10%，甘油产率降低38%
- 乙醇产率从0.480提高到0.531 C-mol/C-mol葡萄糖，甘油产率从0.097降至0.060 C-mol/C-mol葡萄糖。最大比生长速率µmax为0.37 h⁻¹，约为野生型（0.41 h⁻¹）的90%。GDH2过表达菌株TN22的乙醇产率提高至0.495，但低于TN19，其Gdh2p比活力为0.625 U/mg TCP，较野生型提高30倍。菌株TN17中Glt1p活性提高5倍（0.195-0.211 U/mg TCP），而TN19中Gln1p活性为0.062 U/mg TCP。
研究结论
通过修改铵同化途径的辅因子需求，将NADPH消耗改为NADH和ATP消耗，可有效降低甘油产率并提高乙醇产率。过表达GLN1和GLT1并敲除GDH1的菌株TN19在保持接近野生型生长速率的同时，乙醇产率显著提高，验证了通过代谢工程改造生物质合成途径提高乙醇产量的概念。