Accumulation of Methylglyoxal in Anaerobically Grown Escherichia coli and Its Detoxification by Expression of the Pseudomonas putida Glyoxalase I Gene
- 作者
- Marie M. Zhu, Frank A. Skraly, Douglas C. Cameron
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of Wisconsin-Madison
- 杂志
- Metabolic Engineering（2001）
- DOI
- 10.1006/mben.2001.0186
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
厌氧条件下转基因大肠杆菌利用甘油生产1,3-丙二醇时，高浓度甘油（≥5 g/L）抑制细胞生长和产物合成，其中甲基乙二醛（MG）积累是一个重要原因。
研究策略
在大肠杆菌中表达恶臭假单胞菌的乙二醛酶I基因，增强MG解毒能力，从而缓解MG对细胞生长和1,3-丙二醇生产的抑制。
研究路线图
核心内容
该研究针对厌氧条件下转基因大肠杆菌以甘油生产1,3-丙二醇时，高浓度底物引发甲基乙二醛积累进而抑制细胞生长的问题，提出通过异源表达恶臭假单胞菌乙二醛酶I来增强MG解毒能力。作者构建了共表达肺炎克雷伯氏菌dha调节子与恶臭假单胞菌乙二醛酶I基因的质粒pTC13，并转入大肠杆菌AG1。结果显示，对照菌株在厌氧发酵24小时后胞内MG浓度达1.49~1.63 mM，而表达异源乙二醛酶I的菌株酶活较对照提高约12倍，胞内MG降低35%~43%，胞外MG降低30%。在含0.5 mM MG的平板上，工程菌存活率约80%，对照仅2%；无外源MG时工程菌OD660较对照高56%。最终1,3-丙二醇产量由对照的1.38 g/L提升至2.1 g/L，增幅约50%。该工作定量证实了内源MG积累是厌氧甘油发酵的重要抑制因素，并证明好氧菌解毒酶可在厌氧体系中有效发挥作用，为优化1,3-丙二醇及其他厌氧发酵过程提供了可行策略。
创新点
首次在厌氧条件下利用来自好氧菌恶臭假单胞菌的乙二醛酶I进行MG解毒；定量证明MG积累是抑制1,3-丙二醇发酵的重要因素；构建共表达dha调节子和异源乙二醛酶I的质粒pTC13。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli AG1 | 甘油厌氧发酵生成1,3-丙二醇（dha调节子途径） | dha regulon（来自Klebsiella pneumoniae） | 甘油脱水酶，1,3-丙二醇氧化还原酶等 | 催化 | 由质粒pTC9携带，负责将甘油转化为1,3-丙二醇 |
| Escherichia coli AG1 | 甲基乙二醛解毒途径（乙二醛酶I/II途径） | 来自Pseudomonas putida的乙二醛酶I基因 | 乙二醛酶I（glyoxalase I） | 催化 | 克隆于质粒pTC13中，异源表达后酶活提高约12倍，增强MG解毒 |
| Escherichia coli AG1 | 甲基乙二醛合成途径（糖酵解旁路，DHAP转化） | 内源甲基乙二醛合酶基因（mgSA） | 甲基乙二醛合酶（methylglyoxal synthase） | 催化 | 催化磷酸二羟丙酮转化为甲基乙二醛，受无机磷酸抑制 |
关键发现
- 厌氧发酵8和24 h后，转基因大肠杆菌AG1/pTC9胞外MG浓度为0.34~0.47 mM，胞内MG浓度为1.49~1.63 mM
- 表达P. putida乙二醛酶I的菌株AG1/pTC13的乙二醛酶I比活力为132.1±11.5 µmol/min·g蛋白，较对照（11.2±1.2）提高约12倍
- 与对照相比，AG1/pTC13胞内MG降低35%~43%，胞外MG降低30%
- 在含0.5 mM MG的平板上，AG1/pTC13存活率约80%，而对照仅2%
- 无外源MG时，AG1/pTC13的OD660比对照高56%
- 1,3-丙二醇产量从对照的1.38 g/L提高到2.1 g/L，增加50%。
研究结论
内源甲基乙二醛积累抑制了厌氧条件下大肠杆菌的生长和1,3-丙二醇生产；表达恶臭假单胞菌乙二醛酶I可有效降低胞内外MG浓度，显著提高细胞密度和1,3-丙二醇产量，为优化甘油/糖类发酵生产1,3-丙二醇提供了新策略，也展示了好氧菌解毒酶在厌氧体系中的潜在应用。