Expression of Bifunctional Enzymes with Xylose Reductase and Xylitol Dehydrogenase Activity in Saccharomyces cerevisiae Alters Product Formation during Xylose Fermentation
- 作者
- Mikael Anderlund, Peter Rådström, Bärbel Hahn-Hägerdal
- 单位
- Department of Applied Microbiology, Lund University, Lund, Sweden
- 杂志
- Metabolic Engineering（2001）
- DOI
- 10.1006/mben.2001.0190
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中，木糖发酵因NAD+/NADH辅因子失衡导致木糖醇大量分泌、乙醇产量低，通过构建木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）的双功能融合蛋白，旨在促进底物通道化与辅因子循环，减少木糖醇生成并提高乙醇得率。
研究策略
将Pichia stipitis的XYL1和XYL2基因以不同顺序和不同长度的连接肽进行框内融合，构建四个双功能酶编码基因，在酿酒酵母中单独表达或与天然XR/XDH单体共表达，测定酶活性、复合物分子量及氧受限条件下木糖发酵性能。
研究路线图
核心内容
本研究在酿酒酵母中构建了来源于Pichia stipitis的木糖还原酶（XR）与木糖醇脱氢酶（XDH）双功能融合蛋白，以解决木糖发酵中NADH/NAD⁺辅因子失衡导致的木糖醇积累和乙醇产量低的问题。研究者将XYL1和XYL2基因以不同顺序和连接肽长度进行框内融合，构建四种双功能酶，并在酵母中单独表达或与天然单体共表达。结果显示，XDH在N端的融合蛋白（XDH-XR）同时具备两种酶活性，且延长连接肽可提高XDH比活至0.46 U/mg；融合蛋白可形成四聚体至八聚体的多聚复合物。共表达融合蛋白与天然单体的菌株G-104/XDHXR-S的XR和XDH活性（4.15和5.90 U/mg）与对照相当，但在氧受限发酵中，其木糖醇得率从0.62降至0.55，乙醇得率从0.064升至0.077，同时甘油和乙酸生成减少。该结果表明，融合蛋白的邻近效应促进了NADH在XR反应中的循环利用，增强了木糖醇向木酮糖的转化，为通过酶工程策略改善酿酒酵母木糖发酵效率提供了可行方案。
创新点
首次在酿酒酵母中构建并表达同时具有XR和XDH活性的双功能融合蛋白；系统评估了连接肽长度对酶活性和多聚体组装的影响；共表达融合蛋白与天然单体形成杂合复合物，显著提高活性并改善木糖发酵产物分布，降低木糖醇得率。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae GPY55-15Bx | 木糖代谢 | XYL1-XYL2（融合基因） | 双功能融合蛋白XR-XDH | 催化 | 不同连接肽长度的融合蛋白，含XR（N端）与XDH（C端）或XDH（N端）与XR（C端）两种排列。 |
| Saccharomyces cerevisiae GPY55-15Bx | 木糖代谢 | XYL1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | 来源于Pichia stipitis，催化木糖还原为木糖醇，优先利用NADPH，也可利用NADH。 |
| Saccharomyces cerevisiae GPY55-15Bx | 木糖代谢 | XYL2 | 木糖醇脱氢酶（XDH） | 催化 | 来源于Pichia stipitis，催化木糖醇氧化为木酮糖，专一依赖NAD+。 |
关键发现
- 融合蛋白XR-XDH-S（XR在N端）几乎无XR活性（0.012 U/mg），而XDH-XR-S（XDH在N端）同时具有XR和XDH活性
- 连接肽延长可提高XDH比活，G-XDHXR-M为0.36 U/mg，G-XDHXR-L为0.46 U/mg
- 融合蛋白形成四聚体（300 kDa）、六聚体（450 kDa）和八聚体（600 kDa）复合物
- 共表达菌株G-104/XDHXR-S的XR和XDH活性分别为4.15和5.90 U/mg，与对照G-104/YEpPGK（4.30和6.20 U/mg）相当
- 氧受限发酵中，G-104/XDHXR-S消耗49.78 g/L木糖，产生27.33 g/L木糖醇（得率0.55）和3.84 g/L乙醇（得率0.077），而对照G-104/YEpPGK消耗57.33 g/L木糖，产生35.50 g/L木糖醇（得率0.62）和3.66 g/L乙醇（得率0.064）
- G-104/XDHXR-S的甘油和乙酸生成也低于对照。
研究结论
将双功能融合蛋白与天然XR和XDH单体共表达于酿酒酵母，可在保持相似总酶活性的同时降低木糖醇得率（从0.62降至0.55）并提高乙醇得率（从0.064升至0.077），同时减少甘油和乙酸生成，说明融合蛋白的邻近效应促进了NADH在XR反应中的利用，增强了木糖醇向木酮糖的转化，改善了木糖发酵效率。