Controlling the Metabolic Flux through the Carotenoid Pathway Using Directed mRNA Processing and Stabilization
- 作者
- Christina D. Smolke, Vincent J. J. Martin, Jay D. Keasling
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley
- 杂志
- Metabolic Engineering（2001）
- DOI
- 10.1006/mben.2001.0194
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在异源宿主中协调表达代谢通路多基因，平衡通量并控制产物分布；具体而言，如何利用mRNA加工与稳定性元件调控类胡萝卜素合成途径中crtI和crtY的相对表达，从而调节β-胡萝卜素与番茄红素的产量比例。
研究策略
构建由araBAD启动子控制的人工双基因操纵子，将编码mRNA二级结构的DNA片段置于crtI和crtY基因的5'和3'端，并在基因间插入推定RNase E位点；将这些构建体转化至能合成八氢番茄红素的大肠杆菌中，通过改变mRNA二级结构来调节基因表达和代谢通量。
研究路线图
核心内容
该研究将mRNA二级结构介导的稳定性控制策略首次应用于真实的类胡萝卜素合成代谢通路，实现了对通量的定向调控。作者在大肠杆菌中构建了由araBAD启动子控制的人工双基因操纵子，将可形成mRNA二级结构的DNA片段置于crtI和crtY基因的5'和3'端，并在基因间插入推定RNase E位点，通过改变mRNA加工与稳定性来调节两个基因的相对表达水平，从而控制β-胡萝卜素与番茄红素的产量比例。结果显示，仅通过改变mRNA二级结构，β-胡萝卜素相对番茄红素的产量比例就实现了300倍的变化；不同构建体分别积累最多β-胡萝卜素、番茄红素或八氢番茄红素，且总类胡萝卜素水平相近但组分分布显著差异。此外，在含工程化操纵子的细胞中还检测到ζ-胡萝卜素、神经孢烯等通常不可观察的中间产物，表明酶相对表达水平能够影响多步催化反应的中间体积累。该工作证明，利用mRNA加工与稳定性控制可精细调节代谢通量分布，为代谢途径的理性设计与优化提供了通用工具。
创新点
['将前期基于报告基因的mRNA稳定性控制技术首次成功应用于真实代谢通路（类胡萝卜素合成），实现了通量的定向调控。', '通过改变mRNA二级结构，使β-胡萝卜素与番茄红素的产量比例发生300倍变化。', '在无需突变crtI的情况下，通过调节酶相对水平即可积累通常不可观察的中间产物（如ζ-胡萝卜素、神经孢烯、β,ψ-胡萝卜素），证明酶的表达水平可影响多步催化反应中间体的形成。']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH10B | 类胡萝卜素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 编码CrtI，催化八氢番茄红素经多步脱氢生成番茄红素；位于双基因操纵子第二位，其5'端含有不同发夹结构 |
| Escherichia coli DH10B | 类胡萝卜素合成途径 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 编码CrtY，催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素；位于双基因操纵子第一位 |
| Escherichia coli DH10B | 类胡萝卜素合成途径 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 表达于质粒pAC-PHYT上，催化IPP生成GGPP |
| Escherichia coli DH10B | 类胡萝卜素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 表达于质粒pAC-PHYT上，催化GGPP生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli DH10B | 类胡萝卜素合成途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 置于质粒pAC-PHYT+中，但过表达未影响本系统的类胡萝卜素产量 |
| Escherichia coli DH10B | mRNA稳定性控制 | 无 | 无 | 调控 | 5'端发夹结构（HP4、HP16、HP17）及3'端茎环结构用于调节mRNA稳定性；基因间插入推定RNase E位点（E2）介导转录本加工 |
关键发现
['通过改变mRNA二级结构，β-胡萝卜素相对番茄红素的产量比例实现了300倍的变化（1-至300倍）。', 'p70yHP4i菌株积累最多β-胡萝卜素，p70yHP16i积累最多番茄红素，p70yHP17i积累最多八氢番茄红素，p70yi各产物居中。', '所有构建体的总类胡萝卜素（β-胡萝卜素、番茄红素、八氢番茄红素之和）水平相近，但各组分分布差异显著。', '在含pAC-BETA的细胞中仅检测到β-胡萝卜素和八氢番茄红素，而含工程化操纵子的细胞中出现了ζ-胡萝卜素、神经孢烯、β,ψ-胡萝卜素等中间产物。', '前期报告基因系统中，不同控制元件组合可使稳态转录本水平变化1-至500倍，蛋白水平变化1-至1000倍。', 'dxs过表达在本系统中未影响类胡萝卜素产量。']
研究结论
利用定向mRNA加工和稳定性控制，能够协调调控代谢通路中基因的表达，平衡中间产物与终产物的积累，实现对代谢通量的精细调节。该策略可应用于代谢途径的理性设计和优化。