Glycerol Export and Glycerol-3-phosphate Dehydrogenase, but Not Glycerol Phosphatase, Are Rate Limiting for Glycerol Production in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- F. Remize, L. Barnavon, S. Dequin
- 单位
- UMR Sciences pour l'Eneologie, Microbiologie et Technologie des Fermentations, INRA, 2 Place Viala, F-34060 Montpellier Cedex 1, France
- 杂志
- Metabolic Engineering（2001）
- DOI
- 10.1006/mben.2001.0197
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
确定酿酒酵母葡萄糖发酵过程中限制甘油产量的关键步骤（甘油合成或转运）。
研究策略
在酿酒酵母中分别或同时过表达GPD1、GPD2、GPP1，以及表达截短的Fps1p甘油通道变体，比较发酵过程中甘油产量、乙醇、乙醛、生物量及发酵动力学。
研究路线图
核心内容
本研究在酿酒酵母中系统探究了葡萄糖发酵中限制甘油产量的关键因素。通过在V5菌株中单独或组合过表达甘油合成途径的GPD1、GPD2、GPP1，以及表达截短的Fps1p甘油通道变体，比较了各菌株的甘油产量及相关发酵参数。结果表明，过表达GPD1或GPD2的菌株甘油产量分别达24.8和24.3 g/L，为对照的3.3倍，但乙醇减少10-12 g/L，乙醛积累增加，终生物量降低2倍，发酵时间延长60%；而过表达GPP1即使酶活提高7-24倍也不增加甘油产量，表明甘油-3-磷酸脱氢酶是限速步骤，甘油磷酸酶并非限速。表达截短Fps1p使甘油产量达13.2-15.8 g/L，为对照的2.3-2.7倍，但菌株生长缓慢；在该背景下再过表达GPD1虽使甘油额外增加7.1 g/L，却进一步恶化发酵性能。该研究首次明确了甘油生产中的限速酶，并提示过表达GPD1或GPD2才是提高工业酵母甘油产量的更优策略。
创新点
首次证明甘油-3-磷酸脱氢酶（GPDH）是甘油生产的限速步骤，而甘油-3-磷酸酶（GPP）非限速；发现表达组成型开放的Fps1p通道可导致甘油外流增加并促使细胞提高甘油产量，但带来生长缺陷。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (菌株V5) | 甘油生物合成途径 | GPD1 | Gpd1p (甘油-3-磷酸脱氢酶亚型1) | 催化 | 催化磷酸二羟丙酮还原为甘油-3-磷酸，过表达使甘油产量提高3.3倍 |
| Saccharomyces cerevisiae (菌株V5) | 甘油生物合成途径 | GPD2 | Gpd2p (甘油-3-磷酸脱氢酶亚型2) | 催化 | 与GPD1过表达效果相同，甘油产量24.3 g/L，参与氧化还原平衡调控 |
| Saccharomyces cerevisiae (菌株V5) | 甘油生物合成途径 | GPP1 | Gpp1p (甘油-3-磷酸酶) | 催化 | 催化甘油-3-磷酸去磷酸化生成甘油，过表达不提高甘油产量，非限速步骤 |
| Saccharomyces cerevisiae (菌株V5) | 甘油转运 | FPS1 | Fps1p (MIP家族甘油通道蛋白) | 转运 | 介导甘油外排，截断N端150-231氨基酸区域导致组成型开放，进而提高甘油产量但损伤生长 |
关键发现
- 过表达GPD1或GPD2的菌株甘油产量分别达24.8和24.3 g/L，为对照的3.3倍，乙醇减少10-12 g/L，乙醛积累增加，终生物量降低2倍，发酵时间延长60%
- 过表达GPP1不增加甘油产量，在GPD1过表达背景下也不增加（11.7 vs 12.0 g/L），但甘油-3-磷酸酶活性提高7-24倍
- 截短Fps1p（Δ1、Δ3、Δ5）使甘油产量达13.2-15.8 g/L，为对照的2.3-2.7倍，但菌株生长缓慢、发酵延迟
- 在截短Fps1p菌株中过表达GPD1使甘油额外增加7.1 g/L，但生长和发酵性能进一步恶化。
研究结论
GPDH（Gpd1p/Gpd2p）是甘油生产的限速酶，甘油-3-磷酸酶（Gpp1p）不是；Fps1p通道调控甘油外流，但其组成型开放导致生长和发酵缺陷，因此过表达GPD1或GPD2是提高工业酵母甘油产量的更优策略。