Expression and Purification of Dengue Virus Type 2 Envelope Protein as a Fusion with Hepatitis B Surface Antigen in Pichia pastoris
- 作者
- Himani Bisht, Dipti A. Chugh, Sathyamangalam Swaminathan, Navin Khanna
- 单位
- International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, P.O. Box 10504, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India
- 杂志
- Protein Expression and Purification（2001）
- DOI
- 10.1006/prep.2001.1474
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
登革2型病毒包膜蛋白（Den2E）在毕赤酵母中易被蛋白酶降解且表达量低；需要探索稳定高效表达Den2E并保持其抗原性的策略。
研究策略
构建HBsAg与Den2E的两种融合基因（HBsAg-Den2E和Den2E-HBsAg），在毕赤酵母AOX1启动子控制下胞内表达；通过Northern blot和ELISA筛选高表达克隆；采用酸沉淀、Aerosil疏水层析和免疫亲和层析纯化融合蛋白；利用凝胶过滤和CsCl密度梯度离心分析颗粒形成。
研究路线图
核心内容
该研究旨在解决登革2型病毒包膜蛋白（Den2E）在毕赤酵母中表达量低且易被蛋白酶降解的问题。研究者构建了HBsAg与Den2E的两种融合基因（HBsAg-Den2E和Den2E-HBsAg），在AOX1启动子控制下于毕赤酵母GS115中胞内表达，并通过Northern blot和ELISA筛选高表达克隆，采用酸沉淀、Aerosil疏水层析和免疫亲和层析进行纯化。结果显示，Den2E-HBsAg的mRNA稳态水平比反向融合高2–3倍，1%甲醇诱导时表达量约为0.5%甲醇条件下的4.5倍，72小时达到峰值。从约50g湿细胞中获得约1mg纯化融合蛋白，纯化约1400倍，回收率约26%，纯度约95%。该融合蛋白约68kDa，能自发组装成病毒样颗粒，在CsCl梯度中的沉降位置与HBsAg VLP相似，且能被抗Den2E中和抗体3H5和抗HBsAg抗体识别。这表明该策略成功实现了Den2E的高效稳定表达并保留了双组分的抗原性，为多价登革亚单位疫苗的研发提供了可行途径。
创新点
首次在毕赤酵母中实现Den2E与HBsAg融合蛋白的高效表达，该融合蛋白自发组装成病毒样颗粒，且保留了两个组分的中和抗体表位，为多价登革疫苗开发提供新思路。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | — | — | — | 能量供给 | 宿主菌株，his4营养缺陷型，用于整合表达重组蛋白，提供转录翻译所需能量和代谢底物 |
| — | 甲醇代谢途径 | AOX1启动子 | — | 调控 | 甲醇诱导型启动子，控制融合基因表达，AOX1基因本身催化甲醇氧化提供能量 |
| — | — | Den2E-HBsAg融合基因 | Den2E-HBsAg融合蛋白 | 区室化 | 融合基因编码Den2E（前395aa）与HBsAg（全长226aa）的嵌合蛋白，约68kDa；融合蛋白可自发组装成高分子量病毒样颗粒 |
关键发现
- Den2E-HBsAg mRNA稳态水平比HBsAg-Den2E高2-3倍
- 在1%甲醇诱导时表达量比0.5%甲醇高约4.5倍
- 培养至72小时表达达到峰值
- 从约50g湿细胞可获得约1mg纯化融合蛋白，纯化约1400倍，回收率约26%，纯度约95%
- 融合蛋白约68kDa，在Sepharose CL-4B柱上于近外水体积处洗脱，CsCl梯度沉降位置与HBsAg VLP相似
- 该融合蛋白能被抗Den2E中和抗体3H5和抗HBsAg抗体识别。
研究结论
成功在毕赤酵母中表达了Den2E-HBsAg嵌合蛋白，该蛋白纯度较高，能自组装成病毒样颗粒，并保留两个组分的抗原性，表明该方法可用于登革病毒亚单位疫苗的研发。