Expression of a Synthetic Gene Encoding the Anticoagulant-Antimetastatic Protein Ghilanten by the Methylotropic Yeast Pichia pastoris
- 作者
- Robert G. Brankamp, Koti Sreekrishna, Philip L. Smith, Dale T. Blankenship, Alan D. Cardin
- 单位
- Hoechst Marion Roussel, Department of Molecular Genetics, 2110 East Galbraith Road, Cincinnati, Ohio 45215
- 杂志
- Protein Expression and Purification（1995）
- DOI
- 10.1006/prep.1995.0013
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌无法正确折叠富含半胱氨酸的ghilanten，需要选择合适的真核表达系统高效分泌表达具有抗凝活性的重组ghilanten。
研究策略
根据ghilanten氨基酸序列设计合成基因，构建含α-交配因子信号肽和AOX1启动子的毕赤酵母表达质粒pPIC9HG-2，转化KM71和SMD1168菌株，甲醇诱导分泌表达，并用肝素Sepharose亲和层析一步纯化。
核心内容
针对大肠杆菌无法正确折叠富含半胱氨酸的ghilanten蛋白这一难题，本研究选择甲基营养型毕赤酵母作为真核表达宿主。根据氨基酸序列人工设计合成ghilanten基因，构建由AOX1启动子驱动、含α-交配因子信号肽的表达质粒pPIC9HG-2，并转化至KM71和蛋白酶缺陷型菌株SMD1168中，经甲醇诱导实现可溶分泌表达。结果显示，2升摇瓶中重组蛋白分泌量约为10 mg/L，SMD1168菌株的产量约为KM71的两倍。在10升生物反应器中，甲醇诱导后48小时表达量达到峰值，N端测序表明约85%为正确加工的成熟形式，另有约15%在Arg34-Val35位发生非预期切割。通过肝素Sepharose亲和层析一步纯化即可获得重组ghilanten。该工作证实毕赤酵母能够高效表达并分泌具有抗凝活性的ghilanten，蛋白酶缺陷型菌株与发酵条件优化可显著提升产量和加工准确性，为后续结构生物学研究提供了足量且高纯度的目标蛋白。
创新点
采用毕赤酵母真核表达系统实现富含半胱氨酸的抗凝蛋白ghilanten的可溶分泌表达；利用蛋白酶缺陷型菌株SMD1168提高产量约2倍；通过发酵条件优化实现10升规模的成熟蛋白制备。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris SMD1168 | 甲醇利用途径 | AOX1 | 醇氧化酶 | 催化 | AOX1启动子为甲醇诱导型启动子，驱动ghilanten表达；SMD1168为pep4蛋白酶缺陷型菌株，分泌量约为KM71的2倍 |
| Pichia pastoris SMD1168 | 外源蛋白分泌途径 | 合成的ghilanten基因 | ghilanten | 调控 | 重组ghilanten为FXa抑制剂，具有抗凝和抗转移活性，产量约10 mg/L |
| Pichia pastoris SMD1168 | 分泌途径 | MFα1（α-交配因子前导序列） | α-交配因子pre-pro信号肽 | 转运 | 引导ghilanten分泌至培养基 |
| Pichia pastoris SMD1168 | 分泌途径 | KEX2和DAP | Kex2蛋白酶和二肽氨基肽酶 | 催化 | 负责切除信号肽，成熟加工受发酵条件影响 |
关键发现
- 在2升摇瓶BMMC培养基中，重组ghilanten分泌量约10 mg/L
- SMD1168菌株分泌水平约为KM71的2倍
- 10升生物反应器中最大表达出现在甲醇诱导后48小时，产物N端测序显示约85%为正确加工的成熟形式，约15%在Arg34-Val35位被切割
- 通过肝素Sepharose亲和层析一步纯化获得重组ghilanten。
研究结论
毕赤酵母能够高效表达并分泌具有抗凝活性的重组ghilanten，蛋白酶缺陷型菌株及优化发酵条件可提高产量和加工准确性，为结构研究提供足量蛋白。