Divergent Effects of Chaperone Overexpression and Ethanol Supplementation on Inclusion Body Formation in Recombinant Escherichia coli
- 作者
- Jeffrey G. Thomas, François Baneyx
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Box 351750, University of Washington, Seattle, Washington 98195
- 杂志
- Protein Expression and Purification（1997）
- DOI
- 10.1006/prep.1997.0796
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中表达重组蛋白时易形成包涵体，需探索分子伴侣过表达与乙醇添加联合使用对提高可溶性活性蛋白产量的有效性及其机制。
研究策略
以两种易聚集模型蛋白（preS2-S'-β-半乳糖苷酶和人SPARC）为对象，在E. coli JM105和BL21(DE3)中分别共表达DnaK-DnaJ、GroEL-GroES或σ32，并在培养基中添加不同浓度乙醇，考察对包涵体形成和蛋白活性的影响，同时优化乙醇浓度和添加时间，并比较不同培养体积的效果。
核心内容
该研究探讨了在大肠杆菌中联合使用分子伴侣过表达与乙醇补充对重组蛋白包涵体形成和可溶性活性蛋白产量的影响。研究者以preS2-S'-β-半乳糖苷酶融合蛋白和人SPARC蛋白为模型，在JM105和BL21(DE3)菌株中分别共表达DnaK-DnaJ、GroEL-GroES或σ32，并添加不同浓度乙醇进行培养。结果显示，3%乙醇使preS2-S'-β-半乳糖苷酶活性提高1.5至2倍，与DnaK-DnaJ共表达联用时活性较对照提高近5倍，且几乎完全抑制包涵体形成；但在500毫升培养规模中单独使用效果降低，联用仍可提高活性2倍以上。然而，乙醇处理对人SPARC反而促进聚集，GroEL/GroES或σ32过表达无法阻止这一效应，而DnaK/DnaJ仍有效。乙醇处理后细胞中DnaK和GroEL合成率仅增加10%至20%，说明其影响不能简单归因于热休克蛋白浓度升高。该研究表明乙醇对蛋白折叠的影响具有蛋白特异性，与分子伴侣联用可显著提高部分目的蛋白产量，但需针对具体蛋白评估其适用性。
创新点
首次发现乙醇补充与DnaK-DnaJ过表达对preS2-S'-β-半乳糖苷酶折叠具有协同促进作用，但对人SPARC反而促进聚集；表明乙醇的效应不能简单归因于热休克蛋白浓度升高。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM105 | 蛋白折叠 | preS2-S'-β-半乳糖苷酶融合基因（pTBG(H+)） | preS2-S'-β-半乳糖苷酶融合蛋白 | 催化 | 模型蛋白，具有β-半乳糖苷酶活性，易在细胞质中形成包涵体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 蛋白折叠 | 人SPARC cDNA（pSPARCwt） | 人SPARC蛋白 | 调控 | 35 kDa单体糖蛋白，含14个半胱氨酸，易聚集；乙醇促进其包涵体形成 |
| Escherichia coli JM105 | 热休克应答 | dnaKJ operon（pDnaK/J） | DnaK和DnaJ | 调控 | 分子伴侣，过表达可显著提高preS2-S'-β-半乳糖苷酶溶解度，与乙醇联用有协同效应 |
| Escherichia coli JM105 | 热休克应答 | groE operon（pGroESL） | GroEL和GroES | 调控 | 伴侣蛋白，过表达对preS2-S'-β-半乳糖苷酶折叠效果有限，对SPARC无保护作用 |
| Escherichia coli JM105 | 热休克应答 | rpoH基因（pσ32） | σ32因子 | 调控 | 热休克转录因子，过表达可提高热休克蛋白合成率，但对SPARC折叠无改善 |
关键发现
- 在25 ml摇瓶中，3%（v/v）乙醇使preS2-S'-β-半乳糖苷酶活性提高1.5-2倍
- dnaKJ过表达联合乙醇时，活性较对照提高近5倍，且几乎完全抑制包涵体形成
- 500 ml培养中单独使用效果降低，但联用仍产生协同效应，活性提高2倍以上
- 乙醇最适浓度为3%，接种前添加效果最佳
- 低于30°C培养无叠加效应
- 乙醇处理使SPARC聚集增加，GroEL/GroES或σ32过表达无法阻止，但DnaK/DnaJ仍有效
- 乙醇处理后细胞中DnaK和GroEL合成率仅增加10-20%。
研究结论
乙醇对重组蛋白在大肠杆菌细胞质中的折叠具有复杂且多样化的影响，其有益效果需结合具体蛋白的折叠途径评估；与分子伴侣共表达联用可显著提高某些目的蛋白的产量，但对其他蛋白可能有害。