Overproduction, in Escherichia coli, of Soluble Taxadiene Synthase, a Key Enzyme in the Taxol Biosynthetic Pathway
- 作者
- Ke-xue Huang, Qiu-long Huang, Mark R. Wildung, Rodney Croteau, A. I. Scott
- 单位
- Center for Biological NMR, Chemistry Department, Texas A&M University; Institute of Biological Chemistry, Washington State University
- 杂志
- Protein Expression and Purification（1998）
- DOI
- 10.1006/prep.1998.0870
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇生物合成关键酶紫杉二烯合酶在大肠杆菌中异源表达时极易形成包涵体，难以获得可溶性活性蛋白，制约了该酶的生化、动力学及结构研究。
研究策略
采用硫氧还蛋白融合表达载体pET32a(+)，在低温（20°C）下用IPTG诱导，使融合蛋白以可溶形式表达，并通过His标签金属亲和层析一步纯化。
核心内容
紫杉醇生物合成途径中的关键酶紫杉二烯合酶在大肠杆菌中异源表达时极易形成包涵体，严重制约了其生化与结构研究。本研究利用硫氧还蛋白融合表达载体pET32a(+)，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达紫杉二烯合酶，并通过低温（20°C）IPTG诱导策略显著提升蛋白可溶性。结果显示，融合蛋白占总可溶蛋白的15–20%，每500 ml培养物可纯化获得13 mg活性蛋白；经His标签金属亲和层析一步纯化后，比活达81.5 nmol/h/mg，回收率75%。该重组酶对底物GGPP的Km为3.1 μM，Vmax为0.9±0.03 μmol/min/mg，与天然酶（Km 2.9 μM）高度接近，表明融合标签未显著影响酶动力学特性。相比之下，使用pET3d载体表达时蛋白完全形成包涵体且无活性。这一可溶性过表达及一步纯化体系的建立，为紫杉醇生物合成途径的酶催化机制和蛋白质结构研究提供了可行的实验平台，也为其他易聚集的植物萜类合酶在大肠杆菌中的功能表达提供了参考策略。
创新点
首次在大肠杆菌中实现植物来源紫杉二烯合酶的可溶性过表达；利用硫氧还蛋白融合标签显著提高蛋白溶解度；通过单一金属亲和层析步骤即可获得高纯度活性重组酶。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 紫杉醇生物合成途径 | TXS (taxadiene synthase) | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 催化GGPP环化生成taxa-4(5),11(12)-diene，通过pET32TX载体表达为硫氧还蛋白融合蛋白 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 紫杉醇生物合成途径 | crtE (来自Erwinia uredovora) | GGPP合酶 | 催化 | 共表达试验用于增加内源GGPP浓度，文中提及但未展示具体数据 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 紫杉醇生物合成途径 | 截短型TXS（第138位氨基酸起始） | 截短的紫杉二烯合酶 | 催化 | 在pET3d中表达仍形成包涵体，用于探究N端转运肽对溶解性的影响 |
关键发现
- 使用pET32TX载体在20°C诱导下，紫杉二烯合酶融合蛋白占总可溶蛋白的15-20%
- 每500ml培养物可纯化获得13mg活性融合蛋白
- 重组酶对GGPP的Km为3.1 μM（天然酶为2.9 μM），Vmax为0.9±0.03 μmol/min/mg
- 纯化后比活为81.5 nmol/h/mg，回收率75%
- 而pET3d表达时完全形成包涵体，无活性。
研究结论
成功建立了紫杉二烯合酶在大肠杆菌中可溶性高表达及一步纯化的方法，重组融合蛋白的稳态动力学参数和电泳行为与天然酶相似，为紫杉醇生物合成途径及酶催化机制研究提供了可行的实验体系。