Optimizing Functional versus Total Expression of the Human μ-Opioid Receptor in Pichia pastoris
- 作者
- Valérie Sarramegna, Pascal Demange, Alain Milon, Franck Talmont
- 单位
- Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, UMR 5089, 205, Route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex 4, France
- 杂志
- Protein Expression and Purification（2002）
- DOI
- 10.1006/prep.2001.1564
- 所属领域
- 蛋白质表达与纯化
- 关键词
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解决的核心问题
人μ-阿片受体在毕赤酵母中表达水平低，功能性受体产量不足，难以满足结构生物学研究所需的大量纯化蛋白。
研究策略
构建EGFP-人μ-阿片受体融合蛋白，利用EGFP荧光定量总表达量、利用放射性配体结合实验定量功能表达量，系统考察基因拷贝数、菌株类型、诱导温度、pH和甲醇浓度等参数对表达的影响。
核心内容
本研究以毕赤酵母SMD1163为宿主，构建了EGFP与人μ-阿片受体的融合蛋白，通过EGFP荧光定量总表达量、放射性配体结合实验定量功能表达量，系统考察了基因拷贝数、菌株类型、诱导温度、pH及甲醇浓度对受体表达的影响。结果显示，在30°C、pH7.5、0.5%甲醇诱导15小时条件下，功能表达量仅为1 pmol/mg膜蛋白，总表达量为20 pmol/mg。将诱导温度降至20°C并提高pH至10后，功能表达量提升至4 pmol/mg，而总表达量基本不变（18 pmol/mg），功能表达提高4倍；pH5时功能表达仅为pH10的三分之一；5%甲醇使总表达降至最大值的40%；基因拷贝数15–25的菌株与低拷贝菌株表达水平无显著差异。结果表明，低温高pH条件可不增加总蛋白合成而显著提高功能性受体产量，最佳诱导时间为10小时，为大规模生产该受体用于结构生物学研究奠定了工艺基础。
创新点
首次对毕赤酵母中GPCR的总表达与功能表达进行并行监测；发现低温（20°C）和高pH（pH10）条件可使功能受体表达量提高4倍而总表达量不变；证明高基因拷贝数（15-25拷贝）对表达水平无增益。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris SMD1163 | 甲醇利用途径 | AOX1 | 醇氧化酶 | 催化 | AOX1启动子为甲醇诱导型强启动子，驱动EGFP-HuMOR融合蛋白表达 |
| Pichia pastoris SMD1163 | G蛋白偶联受体信号通路 | HuMOR | 人μ-阿片受体 | 调控 | 目标蛋白，七次跨膜GPCR，介导镇痛和成瘾相关信号转导 |
| Pichia pastoris SMD1163 | 蛋白质分泌途径 | MFα1 | α-交配因子信号肽 | 转运 | 来自酿酒酵母的分泌信号肽，引导融合蛋白进入分泌途径 |
关键发现
- 在30°C、pH7.5、0.5%甲醇诱导15h条件下，功能表达量为1 pmol/mg膜蛋白，总表达量为20 pmol/mg
- 优化后（20°C、pH10、0.5%甲醇、诱导10h）功能表达量达4 pmol/mg，总表达量为18 pmol/mg，功能表达提高4倍
- 20°C、pH7.5时功能表达为2 pmol/mg。20°C诱导的峰值功能表达比30°C高4倍
- pH5时功能表达仅为pH10的三分之一
- 5%甲醇为最适浓度，5%甲醇使总表达降至最大值的40%。基因拷贝数15-25的菌株与低拷贝菌株表达水平无显著差异。
研究结论
通过降低诱导温度至20°C并提高pH至10，可在不改变总蛋白合成量的情况下将人μ-阿片受体的功能表达量从1 pmol/mg提高至4 pmol/mg膜蛋白，最佳诱导时间为10小时，该优化条件为大规模发酵生产该受体用于结构研究奠定了基础。