Refolding and Characterization of a Yeast Dehydrodolichyl Diphosphate Synthase Overexpressed in Escherichia coli
- 作者
- Sing-Yang Chang, Pei-Chun Tsai, Chien-Sheng Tseng, Po-Huang Liang
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, Nankang, Taipei 11529, Taiwan
- 杂志
- Protein Expression and Purification（2001）
- DOI
- 10.1006/prep.2001.1511
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
为了对酵母脱氢多萜醇二磷酸合酶（DDPPs）进行动力学和结构研究，需要大量高纯度活性酶，但该酶在大肠杆菌中过表达时主要以包涵体形式存在，可溶性蛋白量极低，因此需要开发有效的复性方法以制备活性酶。
研究策略
利用硫氧还蛋白和His标签融合表达提高重组蛋白溶解度，并采用Ni-NTA亲和层析进行纯化；针对包涵体，使用7 M尿素溶解后经Ni-NTA纯化，通过逐步透析或单步柱上复性去除变性剂，在β-巯基乙醇和去垢剂（Triton X-100或n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷）存在下实现蛋白复性。
研究路线图
核心内容
该研究针对酵母脱氢多萜醇二磷酸合酶（DDPPs）在大肠杆菌中过表达时主要以包涵体形式存在、可溶性活性酶获取困难的问题，开发了有效的复性纯化策略。研究者将酵母Rer2基因与硫氧还蛋白及His标签融合表达于大肠杆菌BL21(DE3)，重组蛋白表达水平达75–100 mg/L培养。在0.1% Triton X-100存在下约25%的DDPPs可溶，而无去垢剂时仅约1%可溶。针对包涵体，采用7 M尿素溶解后经Ni-NTA亲和层析纯化，分别通过逐步透析或单步柱上复性去除变性剂，并在β-巯基乙醇与非离子去垢剂存在下实现复性。从1 L培养液中经可溶途径可获得约14 mg纯化蛋白，而包涵体途径可获46 mg活性酶，两种来源的酶活性相近，kcat为2×10⁻⁴ s⁻¹，IPP的Km为27 μM，且重组酶活性比酵母天然酶高约20倍，产物为C55–C75多萜醇二磷酸。结果表明，β-巯基乙醇对复性至关重要，非离子去垢剂可提高复性时蛋白溶解度。该策略可实现酵母DDPPs的大量高纯度制备，为结构生物学研究和抑制剂开发提供了可行平台。
创新点
开发了从包涵体复性酵母DDPPs的两种有效方法（逐步透析和单步柱上复性），可大量制备高纯度活性酶；发现β-巯基乙醇对复性至关重要而非离子去垢剂可提高复性时的蛋白溶解度；首次实现了酵母DDPPs在大肠杆菌中的大规模活性制备。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 多萜醇合成 | Rer2 | Dehydrodolichyl diphosphate synthase (DDPPs) | 催化 | 基因来源，编码催化IPP与FPP缩合生成脱氢多萜醇二磷酸的酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | Rer2 | Thioredoxin-DDPPs融合蛋白 | 催化 | 重组表达宿主，融合蛋白以可溶或包涵体形式存在 |
| Escherichia coli | 细胞壁合成 | upps | Undecaprenyl diphosphate synthase (UPPs) | 催化 | 作为对照，比较有无Triton X-100对活性的影响 |
关键发现
- 重组DDPPs在E. coli BL21中的表达水平为75-100 mg/L培养
- 在0.1% Triton X-100存在下约25%的DDPPs可溶，无去垢剂时仅约1%可溶
- 从1 L培养液中，通过可溶途径纯化获得约14 mg（含Triton）或0.1 mg（无Triton）纯化蛋白
- 从包涵体纯化复性后获得46 mg活性酶
- 纯化的可溶性和复性DDPPs具有相似活性，kcat = 2×10^-4 s^-1，IPP的Km = 27 μM
- 重组DDPPs的活性比从酵母天然酶高约20倍
- 产物为C55-C75多萜醇二磷酸
- 对照E. coli UPPs在无Triton时kcat为0.013 s^-1，有0.1% Triton时为2.5 s^-1。
研究结论
成功将重组酵母DDPPs从包涵体复性为活性酶，其活性与可溶性酶相似并产生长链产物；β-巯基乙醇对复性必需但对酶活性非必需；非离子去垢剂（Triton X-100和n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷）有助于提高复性过程中的蛋白溶解度；柱上复性需要Triton和β-巯基乙醇同时存在。该表达和纯化策略可方便地制备大量DDPPs，适用于结构研究和抑制剂的开发。